發(fā)光細(xì)菌法作為一種靈敏、 快速、 廉價的生物檢測手段，普遍應(yīng)用于生物毒性的測定. 發(fā)光細(xì)菌受到有害物質(zhì)干擾時，發(fā)光代謝受到影響，根據(jù)有害物質(zhì)的種類與濃度不同，菌體發(fā)光強弱程度不同，據(jù)此以監(jiān)測有害物質(zhì)的毒性[1]. 早在20世紀(jì)30年代，發(fā)光細(xì)菌首先用于快速評價藥物的毒性作用[2]. 隨著對發(fā)光細(xì)菌的認(rèn)識和理解的深入，這種毒性評價技術(shù)逐漸發(fā)展成熟，已成功用于研究苯酚衍生物和硝基苯[3]、 五氯酚鈉[4]、 水環(huán)境中金屬[1]、 土壤中有機污染物2,4,6-三硝基甲苯[5]、 農(nóng)藥[6]等多種物質(zhì)的毒性，該法對生物毒性效應(yīng)具有很好的指示作用，現(xiàn)已成為一種國際通用的標(biāo)準(zhǔn)毒性評價手段. 早期研究發(fā)現(xiàn)，污染物的濃度與發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光度呈一定的線性關(guān)系，但隨著科學(xué)的發(fā)展，越來越多的研究顯示，利用Sigmoidal模型、 Weibull 或Logit 模型等擬合出的“S”型曲線能夠有效地描述污染物的毒性，較線性擬合更加符合毒物與發(fā)光細(xì)菌作用的劑量-效應(yīng)關(guān)系[7, 8]. 目前，國內(nèi)對應(yīng)用發(fā)光細(xì)菌法評價工業(yè)廢水毒性的報道較少. 張秀君等[9]在對造紙、 冶煉、 化工、 采礦等行業(yè)的廢水進行急性毒性監(jiān)測時，指出發(fā)光細(xì)菌法可以較好地評價工業(yè)廢水的毒性. 胡莉莉[10]利用發(fā)光細(xì)菌試驗測試了122種工業(yè)廢水得出結(jié)論，對于COD較高而成分未知的有機廢水，利用發(fā)光細(xì)菌檢測方法可以較好地評價其對生物的毒害效應(yīng). 那廣水等[11]利用發(fā)光細(xì)菌法評價了排污口污水中總有機污染物的毒性作用后，明確指出，該法對工業(yè)廢水中的總有機污染物毒性的評價是準(zhǔn)確和全面的. 而對于制藥廢水利用發(fā)光細(xì)菌法進行綜合生物毒性評價，國內(nèi)的研究更為少見. 李專等[12]曾利用淡水發(fā)光菌對多個制藥廠排水進行綜合生物毒性研究，給出了毒性強弱程度排序，并分析了不同制藥廠排水與水體COD之間的關(guān)系，指出不同制藥廠排水對發(fā)光細(xì)菌的毒性與水體COD并無相關(guān)性. 劉銳等[13]利用明亮發(fā)光桿菌T3小種對維生素制藥各工段排水進行了毒性評價， 得到相應(yīng)水樣的半數(shù)抑制濃度，并對TOC與水樣毒性進行相關(guān)分析，最終給出了排水處理工藝的優(yōu)化建議. 季軍遠(yuǎn)等[14]利用明亮發(fā)光桿菌T3小種對制藥廢水中可能包含的4類抗生素和厭氧消化中間產(chǎn)物進行了毒性評價，得到氨芐青霉素、 林可霉素、 卡那霉素和環(huán)丙沙星的半數(shù)抑制濃度依次為3.99、 5.11、 4.32和5.63 g ·L-1，厭氧消化中間產(chǎn)物乙醇、 乙酸、 丙酸、 丁酸的半數(shù)抑制濃度依次為19.40、 20.71、 10.47和12.17 g ·L-1. 一些發(fā)達國家從20世紀(jì)70年代起，已經(jīng)開始利用發(fā)光細(xì)菌等生物，對排放廢水進行生物毒性評價，并制定相關(guān)的排放標(biāo)準(zhǔn)[15]. 在此期間，美國結(jié)合半數(shù)抑制濃度EC50，提出了廢水急性毒性的評價指標(biāo)單位TUa(acute toxic unit)[16]，TUa與EC50在數(shù)值上的關(guān)系為TUa=100/EC50. 目前，發(fā)光細(xì)菌法已成功應(yīng)用于醫(yī)院[17]、 電鍍[18]等行業(yè)的廢水毒性評價. 歐洲在2000年前后提出了最低無效應(yīng)稀釋度LID(lowest ineflective dilution)[19]，規(guī)定為沒有觀察到抑制作用的最大濃度組的稀釋倍數(shù)值，或者是只觀察到不超過特定測試方法變異性效應(yīng)的最大濃度組的稀釋倍數(shù)值. 它是用于排放廢水管理的毒理學(xué)新概念，直觀地描述了有毒的廢水對受試生物不產(chǎn)生毒害效應(yīng)所需的稀釋倍數(shù). 本研究利用發(fā)光細(xì)菌急性毒性評價制藥廢水在污水處理過程中的毒性削減過程，結(jié)合EC50、 LID和TUa，評價不同處理階段廢水的生物毒性，以期為利用生物毒性評價制藥工業(yè)廢水提供理論依據(jù).
1 材料與方法
1.1 水樣來源
本試驗水樣來自某抗生素制藥廠2012年8月的廢水處理站廢水，該廠廢水font>的處理工藝為接觸氧化法. 選取5個采樣點分別為： ①地下調(diào)節(jié)池、 ②地上調(diào)節(jié)池、 ③中間沉淀池、 ④二級沉淀池和⑤總出水排放口，采集廢水處理工藝構(gòu)筑物中的廢水. 廢水處理工藝流程和采樣點如圖 1所示.
圖 1 各采樣點在處理工藝中的分布情況
1.2 發(fā)光細(xì)菌
明亮發(fā)光桿菌T3小種(Photobacterium phosphorem T3 spp.)，屬于海洋發(fā)光細(xì)菌，購自中國科學(xué)院南京土壤研究所.
1.3 主要試劑與儀器
氯化鈉(NaCl，化學(xué)純).
冰點滲透壓儀，DXY-2型生物毒性測定儀，真空過濾泵，玻璃濾器，保溫箱，4 L玻璃膜口瓶，封口膜，玻璃纖維素膜等.
1.4 樣品處理
水樣經(jīng)玻璃纖維素膜，去除大顆粒雜質(zhì). 按照1.45 g ·(100 mL)-1廢水比例添加氯化鈉，相當(dāng)于3 g ·(100 mL)-1氯化鈉溶液的冰點滲透壓，以保證明亮發(fā)光桿菌T3小種細(xì)胞所需的滲透壓，避免滲透壓對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響.
1.5 發(fā)光細(xì)菌試驗
利用明亮發(fā)光桿菌凍干粉進行廢水不同樣品不同濃度的急性毒性研究. 樣品濃度設(shè)置參照ISO 11348-3[20]的方法交叉等級稀釋，設(shè)置2個平行. 操作步驟嚴(yán)格參照《水質(zhì)-急性毒性的測定-發(fā)光細(xì)菌法》(GB/T 15441-1995)進行，并根據(jù)要求，利用HgCl2對本研究所用發(fā)光細(xì)菌進行敏感性評價[21].
根據(jù)空白樣品的發(fā)光量L0和樣品的發(fā)光量Li，計算樣品的相對發(fā)光度Ii，即：
利用Origin 7.5軟件繪制樣品濃度與發(fā)光細(xì)菌相對發(fā)光度的關(guān)系曲線圖.
1.6 毒性評價
Coleman等[22]根據(jù)樣品濃度和發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光度值EC50之間的關(guān)系，將受試物毒性進行分級，如表 1所示.
表 1 受試物毒性等級
表 2 工業(yè)廢水生物毒性分級
2 結(jié)果與討論
2.1 廢水水質(zhì)分析
根據(jù)該廢水處理廠常年檢測結(jié)果的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，合成廢水的COD值較高，平均為26 721 mg ·L-1，流量較小，為39 m3 ·d-1，氨氮含量較高，為1 760 mg ·L-1; 綜合廢水COD值較低，平均為4 006 mg ·L-1，流量較大，為1 833 m3 ·d-1，氨氮含量較低，為21 mg ·L-1. 該廢水處理廠水中含有大量的抗生素和有機物，具有生物降解難、 有機物含量高等特點. 本研究為隨機采樣，采樣點廢水pH、 COD等常規(guī)理化指標(biāo)測定結(jié)果如表 3所示.
表 3 采樣點廢水的理化數(shù)據(jù) 1)
2.2 地下調(diào)節(jié)池水樣分析
地下調(diào)節(jié)池是廢水處理工藝的第一段工藝，調(diào)節(jié)制藥廠瞬時綜合廢水的流量，即1號水樣. 如圖 2所示，此處廢水毒性較大，濃度為100%時，發(fā)光細(xì)菌的相對發(fā)光度為19.41%. 廢水毒性作用范圍較寬，濃度稀釋至0.07%時，相對發(fā)光度為103.90%. 通過計算可知，該段廢水的EC50=3.44%，TUa=29，LID=625. 該工藝的廢水主要是制藥廢水，其中抗生素含量較高，對發(fā)光細(xì)菌的毒性較大，故得出的最低無效應(yīng)稀釋度較大. 本研究所用菌種HgCl2的EC50=0.10 mg ·L-1，符合國標(biāo)中試驗菌種的敏感性要求[21].
圖 2 1號水樣不同濃度的發(fā)光細(xì)菌相對發(fā)光度
2.3 地上調(diào)節(jié)池水樣分析
地上調(diào)節(jié)池是廢水處理工藝的第二段流程，收納了經(jīng)過地下調(diào)節(jié)池處理并沉淀后的廢水和一部分合成廢水，即2號水樣. 如圖 3所示，該處的廢水毒性較1號水樣毒性更大，廢水濃度為100%時，相對發(fā)光度僅為10.78%. 毒性作用范圍較1號水樣更加寬泛，在濃度為0.03%時，相對發(fā)光度為101.30%. 通過計算可知，該段廢水EC50=2.46%，TUa=41，LID=244. 比較1號和2號水樣的毒性數(shù)據(jù)可知，根據(jù)EC50鑒別廢水的毒性，2號水樣的生物毒性略高于1號，與理化指標(biāo)中COD反映的現(xiàn)象一致. 由于地上調(diào)節(jié)池中混入了合成廢水，污染物成分更加復(fù)雜，有可能產(chǎn)生聯(lián)合毒性效應(yīng)，對發(fā)光細(xì)菌的影響更為明顯，毒性抑制作用更大. 從圖 3中亦可看出，此段廢水在0.07%和0.16%濃度點，發(fā)光細(xì)菌的相對發(fā)光度均明顯高出最低濃度. 該現(xiàn)象推測是在一定的低濃度范圍內(nèi)，毒性物質(zhì)與發(fā)光細(xì)菌相互作用時，具有一定的刺激效應(yīng)，促使發(fā)光量增大，即低劑量興奮作用; 或者是由于廢水中含有一定的營養(yǎng)物質(zhì)，在毒性很低的情況下，營養(yǎng)物質(zhì)促進了發(fā)光細(xì)菌的活動，導(dǎo)致發(fā)光亮增大. 在唐景春等[25]的研究中也出現(xiàn)了相同的情況，他們認(rèn)為可能是由于一些污水中含有可被微生物利用的營養(yǎng)物質(zhì)，這些物質(zhì)的存在促進了發(fā)光菌的發(fā)光活性. 對于這種促進作用，目前沒有研究給出具體的、 確切的解釋，有待日后繼續(xù)深入探討.
圖 3 2號水樣不同濃度的發(fā)光細(xì)菌相對發(fā)光度
2.4 中間沉淀池水樣分析
地上調(diào)節(jié)池的廢水經(jīng)過一級好氧處理后進入中間沉淀池，即3號水樣. 如圖 4所示，在濃度為100%時，發(fā)光細(xì)菌的相對發(fā)光度已經(jīng)高于50%，達到66.60%. 此時的水樣EC50>100%，但由于仍具有一定的毒性，故可獲得最低無效應(yīng)稀釋度，即LID=10. 經(jīng)過好氧生物處理，3號水樣的COD去除率達到93%，其中的有機污染物被微生物氧化分解，水質(zhì)的毒性有了大幅度的削減，對發(fā)光細(xì)菌的抑制作用已經(jīng)明顯減弱，相對發(fā)光度明顯高于1、 2號，但并不是完全無毒性. 該沉淀池的好氧處理過程雖然能處理部分懸浮物質(zhì)，但殘留的有機污染物仍然對發(fā)光細(xì)菌造成了一定的抑制作用[26].
圖 4 3號水樣不同濃度的發(fā)光細(xì)菌相對發(fā)光度
2.5 二級沉淀池水樣分析
中間沉淀池的廢水經(jīng)過A/O池處理后，進入二級沉淀池，即4號水樣. 如圖 5所示，該水樣作用的發(fā)光細(xì)菌相對發(fā)光度均在100%附近，且絕大部分高于100%. 說明此段的廢水對發(fā)光細(xì)菌已無明顯的抑制效應(yīng). 因此，4號水樣對發(fā)光細(xì)菌作用的EC50>100%，LID=1，且100%濃度廢水的發(fā)光細(xì)菌相對發(fā)光度為109.90%. A/O法結(jié)合前段缺氧和后段好氧處理，降解有機污染物，并具有一定的脫氮除磷功能，提高污水的可生化性及氧化效率，結(jié)合反硝化作用完成C、 N、 O在生態(tài)中的循環(huán)，實現(xiàn)污水無害化處理. 因此，從LID的測試結(jié)果可以看出，經(jīng)過A/O工藝處理，完全去除了水質(zhì)對發(fā)光細(xì)菌的毒性抑制作用.
圖 5 4號水樣不同濃度的發(fā)光細(xì)菌相對發(fā)光度
2.6 最終排出口水樣分析
二級沉淀池的水經(jīng)過絮凝沉淀池的再沉淀作用后，最終從污水處理廠的排水口排出，即5號水樣. 如圖 6所示，該水樣對發(fā)光細(xì)菌的影響保持與4號水樣相同的趨勢， 5號水樣的EC50>100%，LID=1. 從數(shù)據(jù)和圖形可見，100%濃度下的發(fā)光細(xì)菌相對發(fā)光度為103.70%，明顯高于《混裝制劑類制藥工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB 21908-2008)中規(guī)定的發(fā)光細(xì)菌急性毒性標(biāo)準(zhǔn)限值，即HgCl2濃度為0.07 mg ·L-1時相對應(yīng)的發(fā)光細(xì)菌相對發(fā)光度75.25%，故總出水排放口水樣已經(jīng)達到排放標(biāo)準(zhǔn)[27].
圖 6 5號水樣不同濃度的發(fā)光細(xì)菌相對發(fā)光度
2.7 水樣COD值與發(fā)光細(xì)菌相對發(fā)光度的關(guān)系
對各采樣點水樣的COD值與100%濃度下對應(yīng)的發(fā)光細(xì)菌相對發(fā)光度進行比較. 相對發(fā)光度以I表示. 具體情況見表 4.
表 4 廢水COD值與發(fā)光細(xì)菌的相對發(fā)光度
從表4中可知，在一定情況下，隨著COD的降低，發(fā)光細(xì)菌的相對發(fā)光度逐漸升高. 對兩組數(shù)據(jù)進行擬合，發(fā)現(xiàn)相對發(fā)光度與COD值、 lg(COD)具有一定的線性關(guān)系，擬合公式分別為式(2)和式(3)：
式中，Y為發(fā)光細(xì)菌相對發(fā)光度，X1和X2分別為COD和lg(COD)值，公式(2) R2=0.869 6，公式(3) R2=0.941 2. 根據(jù)R2值可知，相對發(fā)光度與lg(COD)值的線性關(guān)系較好.
3 問題與建議
(1)在廢水處理工藝中增加生物毒性指標(biāo)，對監(jiān)測廢水中的污染物毒性具有良好的指示作用，但是目前我國對相關(guān)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用還不能構(gòu)成體系.
(2)發(fā)光細(xì)菌在指示工業(yè)廢水毒性時，受廢水中物質(zhì)成分的影響. 對于發(fā)光量不被抑制反被促進的現(xiàn)象還有待進一步研究.
(3)本研究僅針對于該廠夏季廢水處理工藝效果，鑒于季節(jié)差異對該廢水處理工藝的影響較大，故其他季節(jié)的廢水處理能力有待進一步研究.具體參見污水寶商城資料或http://szhmdq.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
4 結(jié)論
(1)污水處理工藝節(jié)點所取1～5號水樣對發(fā)光細(xì)菌的毒性逐漸減弱，最終排出口對發(fā)光細(xì)菌無可見毒性抑制作用，現(xiàn)有廢水處理工藝在夏季能夠有效地降低制藥廢水的生物毒性.
(2)發(fā)光細(xì)菌的相對發(fā)光度與水樣lg(COD)值之間線性相關(guān)性較好，對同一生產(chǎn)階段制藥廢水COD的變化具有一定的指示作用.
(3)在較低的濃度范圍內(nèi)，廢水對發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光反應(yīng)具有促進作用，增大發(fā)光細(xì)菌的相對發(fā)光度.
