石化廢水是石化工業(yè)在生產(chǎn)各種石油產(chǎn)品和有機化工材料過程中產(chǎn)生的廢水. 石化廢水污染物種類多、 成分復(fù)雜、 水質(zhì)水量波動大. 廢水中含有石油類、 苯和苯的衍生物等多種毒性有機物，屬于難降解的工業(yè)廢水[1]. 單一的處理工藝很難達到要求，常采用物化法預(yù)處理，厭氧/好氧生化法二級處理，有些石化企業(yè)為達到更高的排放標準或?qū)崿F(xiàn)回用還設(shè)有深度處理工藝[2, 3]. 其主體工藝為以活性污泥法、 缺氧/好氧(A/O)、 生物流化床等為代表的二級生化處理工藝[4].

　　A/O工藝具有較高的有機物降解和脫氮能力，并且基建和運行費用低，近年來在國內(nèi)外發(fā)展迅速. 溶解氧是O段需要控制的重要指標. 曝氣費用一般占污水運行費用的60%~80%，溶解氧過高會造成能量的浪費，而且影響總氮的去除[5]. 較低的溶解氧會抑制好氧菌的活性，影響有機物的降解和硝化作用[6]. 吳昌永等[7]研究采用A2/O工藝處理生活污水，當O段溶解氧(DO)濃度從4.0 mg ·L-1降到1.0 mg ·L-1時，COD的去除率一直保持在較高的水平，但系統(tǒng)硝化效果降低. Guo等[8]研究表明較低的DO水平(1.5~2.4 mg ·L-1)有利于A/O生物膜反應(yīng)器的快速啟動，而且抗沖擊負荷能力強.

　　目前關(guān)于DO影響的研究大多針對生活污水，對處理實際石化廢水的研究十分有限; 并且缺乏DO對反應(yīng)器微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝機制的影響研究. 傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法操作繁瑣復(fù)雜，得到的信息量有限. Rocher 454測序[9]是一種基于焦磷酸測序原理的高通量基因組測序技術(shù)，具有測序速度快、 讀長長、 通量高、 準確度高和一致性好等優(yōu)點. 它不僅可以獲得樣品中的微生物群落組成，并將其含量進行數(shù)字化，而且可進行種群多樣性和豐度分析[10].

　　本文以實際石化廢水為處理對象，研究DO濃度對A/O反應(yīng)器降解有機物和脫氮除磷效果的影響; 并解析不同DO濃度下微生物的群落特征，以期為A/O工藝運行調(diào)控提供技術(shù)基礎(chǔ).

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗裝置

　　實驗裝置如圖 1所示. 廢水經(jīng)蠕動泵進入A/O反應(yīng)器，出水經(jīng)沉淀池沉降后從頂部溢流堰排出，沉淀池底部的污泥經(jīng)蠕動泵回流至缺氧A段. 反應(yīng)器由有機玻璃制成，分為平行運行的A、 B兩組. 每組由一個A段和兩個好氧段O1、 O2組成，總體積為45 L，A段、 O1段和O2段的比例為1 ∶2 ∶2，沉淀池體積為28 L. 反應(yīng)器在A段設(shè)有機械攪拌，O段采用底部砂棒曝氣. A組反應(yīng)器O段的DO控制在2~3 mg ·L-1，B組反應(yīng)器控制在5~6 mg ·L-1，反應(yīng)器溫度為23~26℃.

　　圖 1 實驗裝置示意

　　1.2 實驗用水和啟動、 運行方案

　　實驗裝置建在我國北方某石化綜合污水處理廠內(nèi). 該污水廠的進水由工業(yè)廢水和生活污水兩部分構(gòu)成，比例約為3 ∶1. 工業(yè)廢水來源于該公司下屬的煉油廠、 化肥廠、 電石廠、 樹脂廠等所有化工廠處理后的出水. 實驗用水取自該污水廠的水解酸化池出水，水質(zhì)指標如表 1所示. 進水COD波動較大，總氮(TN)主要以氨氮為主，總磷(TP)含量比較低.

　　表 1 實驗廢水水質(zhì) 1)

　　接種污泥取自該污水廠的曝氣池. 反應(yīng)器自2013年4月24日啟動，悶曝48 h后開始連續(xù)進水. 水力停留時間(HRT)為30 h，回流比為100%. 經(jīng)過兩周左右的馴化，出水水質(zhì)穩(wěn)定，COD去除率達到70%以上，反應(yīng)器啟動成功. 反應(yīng)器穩(wěn)定運行分兩個階段：自2013月5月20日至2013年9月4日，HRT為30 h; 自2013年9月5日至2013年11月6日，HRT為20 h. 污泥齡(SRT)為50 d.

　　定期(每隔2~3 d)取樣測定反應(yīng)器進水、 出水的COD和氨氮濃度. 不定期檢測進、 出水BOD5、 TN、 TP濃度和反應(yīng)器各段COD和氮化合物的濃度分布. 所有水樣均采用0.45 μm濾膜過濾后再進行分析. 反應(yīng)器運行穩(wěn)定后，取兩組O段污泥樣品進行微生物種群結(jié)構(gòu)解析. 對反應(yīng)器進、 出水進行溶解性微生物產(chǎn)物(SMP)、 蛋白質(zhì)、 多糖和腐殖酸含量以及3D-EEM熒光光譜檢測分析其水質(zhì)特性的變化規(guī)律.

　　1.3 分析方法

　　BOD5、 COD、 氨氮、 硝氮、 亞硝氮和總磷測定均參照國標方法測定[11]. 總有機碳(TOC)和TN使用總有機碳分析儀(TOC-VCPH/CPN,島津)測定. 多糖測定采用苯酚硫酸法，蛋白采用考馬斯亮藍法. 污泥濃度(MLSS)采用重量法測定. DO和水溫采用便攜式溶解氧測定儀(YSI-550A). 采用3D-EEM熒光光度計(Hitachi F-7000)分析出水溶解性有機物質(zhì)的組成[12]，激發(fā)波長(Ex)為200~400 nm，發(fā)射波長(Em)為240~500 nm，狹縫寬度5 nm，掃描速度1 200 nm ·min-1，光電倍增管PMT電壓700 V.

　　微生物種群分析采用454高通量測序法，具體實驗方法如下.

　　1.3.1 DNA提取與純化

　　生物膜樣品的DNA采用E.Z.N.A.土壤DNA提取試劑盒(OMEGA公司)進行提取，實驗按照生產(chǎn)廠商提供的方法進行.

　　1.3.2 PCR擴增

　　DNA樣品采用16S rRNA通用引物(27F和533R)對細菌的V1～V3區(qū)域進行擴增. 前向引物(5′-GCC TTG CCA GCC CGC TCA GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3′)包含454B銜接子序列和細菌通用引物27F序列. 反向引物(5′-GCC TCC CTC GCG CCA TCA GNN NNN NNN NNT TAC CGC GGC TGC TGG CAC-3′)包含454A銜接子序列，隨機組合的10個堿基標記每一種PCR產(chǎn)物和細菌通用引物533R序列. PCR反應(yīng)于20 μL體系中進行，包含0.4 μmol ·L-1正向和反向引物，1 μL模板DNA，200 nmol ·L-1 dNTP和1×FastPfu Buffer. 以不含DNA的PCR水來稀釋. PCR反應(yīng)程序設(shè)定為：94℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25個循環(huán)，最終72℃延伸5 min. 擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測. 擴增產(chǎn)物以AxyPrepTM凝膠回收試劑盒回收(AXYGEN公司).

　　1.3.3 擴增產(chǎn)物檢測、 焦磷酸測序

　　擴增產(chǎn)物DNA濃度用Quant-iT PicoGreen dsDNA試劑盒測定(Invitrogen公司)，DNA樣品以30 μL TE緩沖液稀釋，在微細胞比色皿加入等量2X PicoGreen工作溶液，總反應(yīng)體積60 μL. 以465~485 nm為激發(fā)波長，515~575 nm為發(fā)射波長，采用Turner Biosystems TBS-380熒光光度計測定其熒光強度. 濃度定量測定后，純化后的DNA，等摩爾比例加入到試管中. 焦磷酸測序采用454 GS FLX Titanium測序方法(羅氏)，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行. 在0.03水平進行OTU聚類和物種分類分析. 以MOTHUR軟件以及序列聚類軟件Usearch4.0.38進行序列比較及分析. 所比對的數(shù)據(jù)庫為Silva106 版.

　　2 結(jié)果與討論

　　2.1 DO對A/O反應(yīng)器去除有機物和氮磷的影響

　　A/O反應(yīng)器啟動成功后穩(wěn)定運行近半年的時間. A、 B兩組反應(yīng)器內(nèi)的A段和O的污泥濃度(MLSS)分別保持在3~4 g ·L-1和5~6 g ·L-1，MLVSS/MLSS的比值在71%~75%，污泥活性均較高. 圖 2和圖 3分別為進、 出水COD和氨氮濃度及其去除率隨時間的變化. 兩個HRT下，A、 B兩組反應(yīng)器出水的水質(zhì)指標列于表 2. 可以看出，盡管進水的COD濃度波動較大，但COD的去除率保持穩(wěn)定，A/O反應(yīng)器具有良好的抗沖擊性. 出水的BOD5均低于5 mg ·L-1，說明A/O反應(yīng)器對有機物的生物降解比較徹底. HRT為20 h時出水COD的去除效果優(yōu)于30 h. 在HRT為20 h時，A組反應(yīng)器出水的COD(72.5 mg ·L-1±14.8 mg ·L-1)略高于B組反應(yīng)器出水(68.7 mg ·L-1±14.6 mg ·L-1)，COD平均去除率分別為67.0%和68.8%，TOC的去除率分別為64.4%和69.1%. 說明低DO濃度下運行對有機物的去除沒有顯著影響.

　　表 2 A、 B反應(yīng)器出水指標分析

　　圖 2 進、 出水COD濃度及其去除率隨時間變化

　　圖 3 進、 出水氨氮濃度及其去除率隨時間變化

　　反應(yīng)器運行初期，低DO運行的A組反應(yīng)器出水的氨氮濃度較高，說明硝化菌的活性降低. 但經(jīng)過3個月的運行后，兩組反應(yīng)器出水的氨氮濃度已經(jīng)沒有顯著差別，氨氮的去除率均在90%以上.

　　2.2 反應(yīng)器各段有機物和氮磷去除效率分析

　　A、 B反應(yīng)器各段COD、 NH+4-N、 TN和TP的濃度變化如圖 4所示. A、 B反應(yīng)器的降解趨勢基本一致. 考慮到100%硝化液回流到A段，COD和氨氮在A段大約被稀釋了一倍. COD和氨氮的降解主要發(fā)生在O段. 有機物在O段基本完成降解，二沉池污泥絮凝沉降過程中，也會吸附一部分有機物，使COD濃度進一步降低.

　　氨氮在O段發(fā)生硝化作用轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，硝態(tài)氮在A段發(fā)生反硝化作用轉(zhuǎn)變?yōu)榈獨�，因此TN的去除主要發(fā)生在A段. O段也有一定的去除作用，說明在O段也有一定數(shù)量的反硝化菌. A組反應(yīng)器TN的去除率(31%)略高于B組(26%)，B組反應(yīng)器O段的高溶解氧回流會影響A段的反硝化效果，從而影響TN的去除. 反應(yīng)器出水的TN以硝態(tài)氮為主，亞硝態(tài)氮一直保持在非常低的水平(小于0.07 mg ·L-1)，表明硝化反應(yīng)進行得較為完全. 出水硝態(tài)氮的增加主要來自氨氮和有機氮的轉(zhuǎn)化.

　　對于TN，左側(cè)柱狀圖為反應(yīng)器A，右側(cè)為反應(yīng)器B

　　圖 4 A、 B反應(yīng)器沿程COD、 NH4-N、 TN和TP濃度變化

　　A/O反應(yīng)器對于總磷的去除通過厭氧釋磷、 好氧吸磷最終排泥而去除. B組反應(yīng)器TP的去除率略高于A組，分別為39%和34%，說明聚磷菌的活性均較強. 出水總磷濃度低于1.0 mg ·L-1，達到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標準》一級標準.

　　2.3 A/O反應(yīng)器進、 出水溶解性有機物質(zhì)組成分析

　　SMP是由于基質(zhì)代謝(通常與生長相關(guān))和污泥衰減釋放的一類有機化合物，對于生化處理污水的出水水質(zhì)和處理效率有重要影響，其主要成分為腐殖酸，多糖和蛋白質(zhì)[13]. 進水中SMP所占COD的質(zhì)量分數(shù)為30%左右，出水SMP對COD的貢獻增至70%~75%. 進水及A、 B反應(yīng)器出水SMP各組分的濃度變化如圖 5所示. 多糖和蛋白質(zhì)的降解主要依靠微生物自身的代謝，而腐殖酸幾乎不能被微生物利用，只能依靠排泥去除. 蛋白質(zhì)最容易被微生物利用，其次是多糖，去除率分別為61.3%和48.9%，腐殖酸的去除率只有16.5%. A、 B反應(yīng)器對蛋白質(zhì)和腐殖酸的去除效率基本相同，低DO運行的A反應(yīng)器對多糖的降解效率比B反應(yīng)器高20%左右.

　　圖 5 進、 出水SMP各組分的變化

　　對反應(yīng)器進出水進行3D-EEM掃描，結(jié)果表明進水中主要有3個峰，分別對應(yīng)為酪氨酸類物質(zhì)、 色氨酸類物質(zhì)和SMP類物質(zhì)[14]. 經(jīng)過A/O反應(yīng)器處理后，色氨酸類物質(zhì)的峰基本消失，水中主要為酪氨酸和SMP物質(zhì)，峰的強度較進水均顯著減小，表明這些物質(zhì)已被生物降解. A反應(yīng)器出水峰的強度略高于B反應(yīng)器出水.

　　2.4 不同DO條件下反應(yīng)器O段污泥微生物種群結(jié)構(gòu)解析

　　表 3為A、 B反應(yīng)器O段污泥樣品的454測序結(jié)果. 其中豐富度指數(shù)Ace和Chao1是估計群落中含有OUT數(shù)目的指數(shù)，生態(tài)學(xué)中常用來估計物種總數(shù). 多樣性指數(shù)Shannon和Simpson用來估計群落中OUT多樣性高低的群落多樣性指數(shù). Shannon 值越大，Simpson越小，說明群落多樣性越高. 從表 3數(shù)據(jù)可以看出，高DO運行的反應(yīng)器B具有較高的菌群豐度和多樣性，表明較高的DO濃度有利于好氧菌的生長和繁殖.

　　表 3 細菌種群多樣性指數(shù)特征 1)

　　在門的水平，兩個反應(yīng)器O段污泥細菌種群分布如圖 6所示. 主要優(yōu)勢菌群依次為變形菌門 (Proteobacteria)、 浮霉菌門 (Planctomycetes)、 擬桿菌門 (Bacteroidetes)、 綠彎菌門 (Chloroflexi)、 酸桿菌門 (Acidobacteria)、 放線菌門(Actinobacterium)、 藍藻門(Cyanobacteria)、 綠菌門(Chlorobi)、 厚壁菌門(Firmicutes)、 芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae). 變形菌門、 浮霉菌門和擬桿菌門菌群所占比重較大，在A、 B反應(yīng)器中的比例分別為58.7%和59.2%、 14.7%和12.7%以及10.8%和12.4%，總和加起來接近85%. A、 B兩個反應(yīng)器比較，低DO運行的A反應(yīng)器浮霉菌門、 厚壁菌門和芽單胞菌門細菌比例高于B反應(yīng)器; 高DO運行的B反應(yīng)器中擬桿菌門、 放線菌門、 綠菌門和硝化螺旋菌門細菌所占的比例高于A反應(yīng)器. 污泥中的優(yōu)勢菌群變形菌門是細菌中最大的一門，包括很多好氧、 厭氧或兼性細菌，具有多種代謝種類，也有一些無機化能種類(如可以氧化氨氮的亞硝化單胞菌屬Nitrosomonas)，能夠在降解有機物的同時完成脫氮除磷功能. 浮霉菌門是一小門水生細菌，在海水和淡水中都可被發(fā)現(xiàn). 擬桿菌門菌群常在除磷系統(tǒng)中被報道，可降解蛋白質(zhì)、 糖類等物質(zhì)[15, 16].

　　僅列出大于0.5%的數(shù)據(jù)

　　圖 6 在門的水平上，A、 B反應(yīng)器污泥細菌菌群的相對豐度

　　在屬的水平鑒定出的主要優(yōu)勢菌及其豐度如表 4所示. 可以看出，較高的DO有利于硝化作用，反應(yīng)器中B中氨氧化菌Nitrosomonas和亞硝酸氧化菌Nitrospira的比例較高. 一些專性好氧菌如Planctomyces的豐度高. 一些厭氧反硝化菌如Azospira和Acidovorax[17]以及聚糖菌Defluviicoccus在A反應(yīng)器中的含量較高. 值得一提的是，有報道指出，鑒定出的Novosphingobium屬、 Comamonas屬、 Sphingobium屬和Altererythrobacter屬細菌具有降解多種多環(huán)芳烴、 氯代硝基苯、 農(nóng)藥和石油化合物的功能[18, 19, 20]，有利于石化廢水的降解.具體參見污水寶商城資料或http://szhmdq.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　表 4 在屬的水平鑒定出的主要優(yōu)勢菌及其豐度

　　3 結(jié)論

　　(1)盡管石化廢水的進水COD濃度波動較大，但A/O反應(yīng)器出水COD的去除率保持穩(wěn)定. 在HRT為20 h時，A組反應(yīng)器出水的COD(72.5 mg ·L-1±14.8 mg ·L-1)略高于B組出水(68.7 mg ·L-1±14.6 mg ·L-1)，COD平均去除率分別為67.0%和68.8%; 出水氨氮的平均濃度和去除率均為0.8 mg ·L-1和95%. 這表明DO在2~6 mg ·L-1范圍內(nèi)，DO濃度對有機物和氨氮的降解沒有顯著影響. 系統(tǒng)保持在低DO(2~3 mg ·L-1)運行可以大大減少曝氣費用.

　　(2)A、 B反應(yīng)器TN和TP的去除率分別為30%和26%，34%和39%. 進水主要為酪氨酸類、 色氨酸類和SMP類物質(zhì)，A/O反應(yīng)器出水主要為酪氨酸和SMP類物質(zhì)，峰的強度較進水均顯著減小.

　　(3)對O段污泥進行454高通量測序結(jié)果表明：優(yōu)勢菌群為變形菌門、 浮霉菌門和擬桿菌門菌群. 高DO運行的反應(yīng)器B具有較高的菌群豐度和多樣性，氨氧化菌Nitrosomonas和亞硝酸氧化菌Nitrospira的比例較高. 一些厭氧反硝化菌如Azospira和Acidovorax在A反應(yīng)器中的豐度較高. 兩個反應(yīng)器均檢測出具有降解多種多環(huán)芳烴、 氯代硝基苯、 農(nóng)藥和石油化合物功能的Novosphingobium屬、 Comamonas屬、 Sphingobium屬和Altererythrobacter屬細菌.(來源及作者：清華大學(xué)核能與新能源技術(shù)研究院 丁鵬元、初里冰 中國地質(zhì)大學(xué)(北京)水資源與環(huán)境學(xué)院 張楠湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 王星 清華大學(xué)核能與新能源技術(shù)研究院 王建龍)