蚯蚓生物濾池集過濾吸附、好氧分解和污泥減量處理等功能于一體，已在多個(gè)國家得到研究和實(shí)踐。蚯蚓生物濾池作為一種生態(tài)型污水污泥同步處理技術(shù)，常用于農(nóng)村地區(qū)的分散式污水污泥處理，是一種綠色友好型技術(shù)。病原菌的去除是剩余污泥農(nóng)用的重要環(huán)節(jié)，隨著蚯蚓生物濾池相關(guān)研究的深入，關(guān)于其對(duì)剩余污泥病原菌去除的研究逐漸展開。通過靜態(tài)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蚯蚓生物濾池生物膜中分離純化培養(yǎng)出的多個(gè)菌株對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和克雷伯氏菌等典型病原菌表現(xiàn)出抑制作用，說明蚯蚓生物濾池對(duì)污水和剩余污泥中病原菌及指示菌的豐度具有削減作用，且可能與其生物膜微生物的拮抗作用有關(guān)。另外，蚯蚓體腔液含有大量免疫細(xì)胞及其分泌的活性分子，相關(guān)研究表明，蚯蚓體腔液中含有抗菌成分，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抑制效果；另有研究表明，蚯蚓的勻漿上清液對(duì)豬場(chǎng)中分離的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌及副豬嗜血桿菌都有抑制效果；而蚯蚓脂肪及脂肪酸在抑菌和抗菌物理屏障中也發(fā)揮了相應(yīng)作用，但二者在濾池中適應(yīng)環(huán)境、抵抗微生物入侵發(fā)揮的作用仍未知，蚯蚓生物濾池中蚯蚓體腔液蛋白表達(dá)是否不同于其他環(huán)境也缺少相關(guān)探索。筆者借助GC/MS分析和蛋白組學(xué)等技術(shù)手段，借鑒免疫生態(tài)學(xué)領(lǐng)域相關(guān)概念和研究思路，分析蚯蚓生物濾池中活性物質(zhì)對(duì)典型病原菌去除的影響，以期為利用蚯蚓生物濾池安全處置剩余污泥提供理論支撐。
1、材料與方法
1.1 試驗(yàn)裝置與材料
試驗(yàn)用污泥為上海市曲陽污水廠二沉池污泥，其含水率為99.3%~99.6%，pH為6.8~7.3，TCOD為4200~9000mg/L，SS為4000~7500mg/L，VSS/SS為52.1%~82.9%。試驗(yàn)裝置為蚯蚓生物濾池（VF），如圖1所示。試驗(yàn)蚯蚓采用赤子愛勝蚓，VF中添加個(gè)體質(zhì)量在0.3~0.5g范圍內(nèi)的健康成年蚯蚓，蚯蚓投加密度為32g/L濾料。在蚯蚓生物濾池四層結(jié)構(gòu)各層中部取蚯蚓樣品混合后用于后續(xù)試驗(yàn)，并另外挑選體質(zhì)量為0.3~0.5g牛糞養(yǎng)殖的健康成年蚯蚓作為對(duì)照。
1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
采用式（1）計(jì)算濾池對(duì)剩余污泥中典型病原菌的絕對(duì)去除率（RE）。
式中：VSSinf、VSSeff分別為進(jìn)、出泥中的揮發(fā)性懸浮固體含量，mg/L；Abundinf、Abundeff分別為進(jìn)、出泥中病原菌的相對(duì)豐度，%。
提取蚯蚓體腔液和組織脂肪，并對(duì)體腔液進(jìn)行粗蛋白組分分離。使用超濾膜切割分子質(zhì)量分別為3、10和30ku的Millipore超濾離心管，將體腔液中的蛋白分為0~3、3~10、10~30、>30ku四個(gè)分子質(zhì)量范圍的粗蛋白。對(duì)于提取后的活性物質(zhì)，通過微量稀釋法測(cè)定其抑菌效果。
針對(duì)試驗(yàn)結(jié)果采用GraphPadPrismv8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)其統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性；并采用GC/MS對(duì)提取的濾池蚯蚓和對(duì)照蚯蚓粗脂質(zhì)進(jìn)行脂肪酸組分分析；同時(shí)對(duì)濾池蚯蚓及對(duì)照蚯蚓體腔液進(jìn)行iTRAQ蛋白質(zhì)組定量并進(jìn)行差異蛋白分析。
1.3 活性物質(zhì)抑菌能力測(cè)定方法的構(gòu)建
沙門氏菌、大腸桿菌與金黃色葡萄球菌均為VF去除效果較顯著的菌種，以剩余污泥沙門氏菌與沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為對(duì)比，可以分析剩余污泥及濾池環(huán)境對(duì)沙門氏菌抑制能力的影響；以大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為常見指示菌，金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為典型革蘭氏陽性致病菌與前述革蘭氏陰性菌作對(duì)照；因此選取剩余污泥內(nèi)分離純培養(yǎng)的沙門氏菌、沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC14028）、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC25923）作為試驗(yàn)菌株。為方便記述，剩余污泥沙門氏菌記為sludgeSal.、沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株記為stdSal.、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株記為stdEco.、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株記為stdSau.。
由于蚯蚓數(shù)量限制，根據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）的說明，選用硫酸慶大霉素作為標(biāo)準(zhǔn)品，通過測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品的最小抑菌濃度（MIC）以及標(biāo)準(zhǔn)品二倍梯度稀釋液對(duì)應(yīng)的96孔板抑菌培養(yǎng)前后吸光度（OD）擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，將一倍濃度體腔液及粗蛋白溶液在抑菌反應(yīng)前后對(duì)應(yīng)的96孔板OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，把蚯蚓活性物質(zhì)抑菌能力折算為同等抑菌強(qiáng)度硫酸慶大霉素濃度進(jìn)行互相比較。
硫酸慶大霉素對(duì)sludgeSal.、stdSal.、stdEco.、stdSau.的MIC分別為2.0、1.0、2.0、0.5μg/mL，表明不同種類病原菌或指示菌對(duì)同劑量的同種抑菌藥物的抗性有所不同，其中stdSau.對(duì)硫酸慶大霉素最為敏感，sludgeSal.較stdSal.的耐藥性更強(qiáng)，說明剩余污泥環(huán)境馴化的沙門氏菌菌株相對(duì)而言耐藥性提高，這與環(huán)境中抗性基因的傳播有關(guān)。參考CLSI的MIC解釋標(biāo)準(zhǔn)，4種試驗(yàn)菌株均對(duì)硫酸慶大霉素敏感。
微孔OD值與菌液濃度呈線性關(guān)系，且試驗(yàn)采用的菌種均提前一天活化，同時(shí)經(jīng)12h培養(yǎng)并處于對(duì)數(shù)生長期，通過延長硫酸慶大霉素濃度稀釋梯度，建立濃度與微孔OD值變化量之間的指數(shù)關(guān)系，將蚯蚓活性物質(zhì)抑菌能力轉(zhuǎn)化為硫酸慶大霉素濃度進(jìn)行對(duì)比，曲線方程如式（2）所示。針對(duì)各菌取MIC后的7個(gè)稀釋梯度進(jìn)行擬合，OD實(shí)測(cè)值與擬合曲線見圖2。
式中：y為OD值變化量；x為硫酸慶大霉素濃度，μg/mL。
1.4 蚯蚓活性物質(zhì)組分分析方法
1.4.1 GC/MS分析脂肪酸組分
定性分析：對(duì)檢測(cè)出的成分采用MS數(shù)據(jù)庫NIST11和保留時(shí)間進(jìn)行定性。數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)果中要扣除雜質(zhì)峰、柱流失峰。
定量分析：采用面積歸一化法定量，即以鑒定成分峰面積占所有鑒定成分面積之和的百分比作為定量結(jié)果。
式中：Ci為某一鑒定成分含量，%；Ai為對(duì)應(yīng)某一鑒定成分的峰面積；n為鑒定成分總數(shù)。
1.4.2 iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)分析
由于本試驗(yàn)樣品為蚯蚓體腔液，在搜庫比對(duì)時(shí)，選擇蚯蚓所屬的環(huán)節(jié)動(dòng)物門蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。
2、結(jié)果與討論
2.1 裝置運(yùn)行效果及對(duì)病原菌的抑制能力
裝置運(yùn)行效果由SS、VSS及VSS/SS進(jìn)行表征。其中，VSS代表污泥中的有機(jī)固體含量，是污泥減量的重要指標(biāo)；VSS/SS是污泥穩(wěn)定化指標(biāo)，其值越低即表明污泥礦化程度和穩(wěn)定化效果越好。在進(jìn)泥濃度為（424±12）mg/L、水力負(fù)荷為2.0m3（/m2·d）、有機(jī)負(fù)荷為0.3kgVSS/（m3·d）的條件下，VF的SS和VSS減量率分別為（46.1±2.5）%、（57.5±1.7）%，VSS/SS值為53.1%；無蚯蚓的生物濾池（BF）的SS和VSS減量率分別為（31.9±1.6）%、（36.6±1.4）%，VSS/SS值為62.0%。相比之下，VF具有更好的污泥穩(wěn)定化處理效果。
根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)篩選市政污水和污泥中的典型病原菌及指示菌共11種。BF對(duì)11種病原菌及指示菌的平均去除率為40.2%，VF對(duì)其平均去除率為58.0%，較BF具有更高的病原菌削減作用。在11種病原菌中，VF對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌和大腸桿菌的去除率相較于BF有顯著提高，分別提高了37.2%、27.1%、24.3%和19.8%，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌在VF出泥中的相對(duì)豐度較BF出泥有明顯降低，即引入蚯蚓使VF對(duì)這3種病原菌具有更優(yōu)的抑制削減作用。
2.2 蚯蚓脂肪對(duì)典型病原菌的抑制能力
根據(jù)1.3節(jié)的方法測(cè)定蚯蚓脂肪對(duì)試驗(yàn)菌株的抑菌能力，結(jié)果顯示，濾池蚯蚓脂肪（VEL）和對(duì)照蚯蚓脂肪（CEL）均對(duì)stdSau.無抑制作用，與相關(guān)研究結(jié)果一致；VEL對(duì)于sludgeSal.、stdSal.和stdEco.的抑制能力分別等同于（0.22±0.02）、（0.18±0.02）、（0.13±0.01）μg/mL硫酸慶大霉素藥液；CEL對(duì)其抑制能力分別等同于（0.23±0.01）、（0.23±0.01）、（0.13±0.01）μg/mL硫酸慶大霉素藥液。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果，蚯蚓脂肪對(duì)sludgeSal.、stdSal.的抑菌能力在CEL組和VEL組具有顯著差異，但對(duì)stdEco.則沒有，而且CEL對(duì)前兩種菌的抑制效果更好，由此認(rèn)為濾池的馴化并未提高蚯蚓脂肪的抑菌能力。
2.3 蚯蚓脂肪酸組分與抑菌能力分析
對(duì)VEL和CEL進(jìn)行GC/MS測(cè)定，結(jié)果顯示VEL中含25種脂肪酸、CEL含10種脂肪酸，其中相同的脂肪酸有10種。共有脂肪酸在CEL中的相對(duì)占比約為21.6%，而在VEL中的相對(duì)占比約為34.6%。對(duì)比差異脂肪酸組成，VEL擁有15種特有脂肪酸，且4種為中鏈脂肪酸，分別為環(huán)己甲酸、苯甲酸、癸酸、十一酸，但這4種中鏈脂肪酸的相對(duì)占比僅為0.55%，其余均為長鏈脂肪酸。VEL的脂質(zhì)總含量、脂肪酸組分多樣性和相對(duì)豐度都普遍高于CEL，但在抑菌效果上卻沒有表現(xiàn)出更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，且脂肪主要分布在蚯蚓的體壁和消化道中，這些部位是蚯蚓抵抗外來物質(zhì)入侵的主要物理屏障，由此認(rèn)為VEL脂肪酸及相對(duì)占比增加與適應(yīng)濾池及剩余污泥環(huán)境有關(guān)，并不直接參與抑菌過程。
2.4 蚯蚓體腔液及其蛋白粗組分的抑菌能力
濾池蚯蚓體腔液（VECF）和對(duì)照蚯蚓體腔液（CECF）對(duì)不同試驗(yàn)菌種的抑制能力具有一定差異，其中CECF對(duì)sludgeSal.、stdSal.、stdEco.和stdSau.的抑制能力分別等同于（0.28±0.01）、（0.31±0.01）、（0.33±0.02）、（0.16±0.01）μg/mL硫酸慶大霉素藥液；VECF對(duì)4種菌的抑制能力分別等同于（0.35±0.01）、（0.34±0.01）、（0.38±0.01）、（0.17±0.01）μg/mL硫酸慶大霉素藥液，比BF分別高出25.0%、9.7%、15.2%和6.3%，平均高出14.1%。兩類蚯蚓體腔液對(duì)stdSau.的抑制作用均低于其他3種菌，推測(cè)是由于革蘭氏陽性菌較革蘭氏陰性菌具有寬而致密的細(xì)胞壁，因而更不容易成為抗菌藥物的靶標(biāo)；而且根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，蚯蚓體腔液對(duì)sludgeSal.、stdSal.和stdEco.的抑菌能力在VECF組和CECF組具有顯著差異，而對(duì)stdSau.則沒有；對(duì)于除stdSau.外的其他3種菌，VECF都表現(xiàn)出更高的抑制作用，由此認(rèn)為濾池的馴化提高了蚯蚓體腔液的抑菌能力。
測(cè)定不同分子質(zhì)量范圍的粗蛋白對(duì)試驗(yàn)菌種的抑制能力后，換算為同等抑制能力的硫酸慶大霉素藥液濃度，如表1所示。可以看出，VECF中除0~3ku之外的3個(gè)分子質(zhì)量范圍粗蛋白對(duì)sludgeSal.的抑制能力均高于CECF，這與VECF對(duì)sludgeSal.具有更高抑菌能力的結(jié)果一致；VECF中3~10ku粗蛋白對(duì)sludgeSal.的抑制能力以及10~30ku粗蛋白對(duì)StdEco.的抑制能力分別約為CECF的1.7倍和1.4倍，說明為了適應(yīng)剩余污泥和濾池環(huán)境，濾池蚯蚓提高了分子質(zhì)量在3~10、10~30ku范圍的抑菌蛋白表達(dá)。
2.5 體腔液iTRAQ蛋白質(zhì)組與抑菌能力分析
2.5.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控評(píng)估與樣本對(duì)比
為進(jìn)一步了解蚯蚓體腔液蛋白組分，對(duì)VECF和CECF進(jìn)行iTRAQ蛋白質(zhì)組分析。分別設(shè)立3組生物學(xué)重復(fù)，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法，通過肽段匹配誤差分布、肽鏈長度分布對(duì)高分辨質(zhì)譜所檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和質(zhì)控。圖3宏觀反映了檢測(cè)結(jié)果和數(shù)據(jù)的質(zhì)量，可以看出，肽段誤差能夠控制在20×10-6范圍內(nèi)，酶解肽鏈長度符合多數(shù)分布在5~20bp的質(zhì)控要求。
為了分析蚯蚓體腔液樣本的相關(guān)性，繪制主成分分析圖（如圖4所示），各個(gè)樣本點(diǎn)之間的距離越近表明樣本相似性越高。由圖4可見，同組樣本之間具有良好的重復(fù)性，而且CECF組和VECF組樣本之間具有明顯差異。
2.5.2 全蛋白組鑒定及功能注釋
試驗(yàn)iTRAQ選取環(huán)節(jié)動(dòng)物蛋白庫進(jìn)行注釋，共注釋到276種蛋白，分子質(zhì)量分布見圖5。
GO數(shù)據(jù)庫共注釋到203種蛋白。從分子功能層面注釋，二級(jí)條目中結(jié)合功能和酶的活性分別注釋到158和122種蛋白，是蚯蚓體腔液蛋白的主要分子功能。結(jié)合功能三級(jí)條目以離子、雜環(huán)化合物、有機(jī)環(huán)狀化合物和碳水化合物衍生物結(jié)合為主，與有機(jī)物代謝生物過程富集蛋白結(jié)果一致；酶的活性三級(jí)條目以水解酶、轉(zhuǎn)運(yùn)酶和氧化還原酶活性為主。而動(dòng)物處于應(yīng)激狀態(tài)的典型特征是機(jī)體的氧化還原平衡被破壞，通過調(diào)控氧化還原酶和抗氧化酶的活性保證機(jī)體氧化還原平衡，提高免疫水平，研究證實(shí)蚯蚓也具有通過調(diào)控氧化還原平衡進(jìn)行應(yīng)激免疫調(diào)節(jié)的能力，可從分子功能層面證實(shí)蚯蚓體腔液對(duì)免疫系統(tǒng)的重要作用。
2.5.3 差異蛋白的篩選鑒定
以CECF為參照分析VECF中的差異蛋白，采用上調(diào)蛋白FC>1.2、下調(diào)蛋白FC30ku的有6種，在0~3、3~10、10~30ku范圍各1種。VECF與CECF鑒定的差異蛋白中有7種蚯蚓蛋白顯著上調(diào)，具體包括4種胞外珠蛋白片段和3種血紅蛋白連接鏈蛋白片段，血紅蛋白屬于珠蛋白，珠蛋白是具有攜氧能力的蛋白質(zhì)，即上調(diào)的蚯蚓蛋白均與機(jī)體氧氣運(yùn)輸有關(guān)。而且胞外珠蛋白-4在蚯蚓處于金屬鎘污染和病原菌EscherichiacoliO157：H7刺激時(shí)同樣表達(dá)上調(diào)，其機(jī)理尚不清楚，但推測(cè)更高的珠蛋白表達(dá)為蚯蚓機(jī)體提供更多貯存氧氣，從而滿足應(yīng)激調(diào)節(jié)等生理功能需求。3種顯著下調(diào)蚯蚓蛋白分別為lysenin相關(guān)蛋白、肌動(dòng)蛋白和一種未準(zhǔn)確定性的胞外蛋白。蚯蚓受致病菌EscherichiacoliO157：H7和高濃度土霉素刺激后一段時(shí)間內(nèi)lysenin相關(guān)蛋白和肌動(dòng)蛋白也均出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，說明濾池環(huán)境中蚯蚓機(jī)體呈現(xiàn)應(yīng)激狀態(tài)。
2.5.4 差異蛋白的功能注釋分析
由差異蛋白的GO注釋發(fā)現(xiàn)，大多注釋到的生物過程均同時(shí)具有上調(diào)與下調(diào)蛋白，但調(diào)節(jié)生物過程和信號(hào)發(fā)送過程中均只有差異上調(diào)蛋白R7T3U1和A0A2C9K037。A0A2C9K037是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，蚯蚓免疫應(yīng)激研究中也鑒定出多種MAPK通路蛋白。組蛋白和MAPK都具有遺傳序列保守性，在不同物種間保持較為相似的結(jié)構(gòu)和序列，因而雖然以上兩蛋白注釋為其他物種，在蚯蚓體內(nèi)應(yīng)具有相似的功能。由此推測(cè)VECF中細(xì)胞較CECF具有更高的應(yīng)激活性。
另外對(duì)差異蛋白進(jìn)行KEGG通路富集（見圖6），可知蛋白富集率最高的均為代謝通路，其中，萜類化合物是動(dòng)植物體內(nèi)廣泛存在的化學(xué)物質(zhì)，具有殺菌作用，其下調(diào)與免疫機(jī)能受損有關(guān)；酮體是脂肪代謝產(chǎn)物，可成為能源物質(zhì)參與代謝，能源代謝的提高有利于生物體抵抗病原體感染。置信度最高的KEGG差異通路為細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞通路和沙門氏菌感染通路；肌動(dòng)細(xì)胞上調(diào)除了與囊泡和SCV合成相關(guān)，也間接引發(fā)伴隨細(xì)胞膜起皺的巨胞飲作用，巨胞飲作用是病原菌進(jìn)入宿主細(xì)胞的快捷途徑。KEGG富集通路證實(shí)濾池蚯蚓除了表現(xiàn)出更高的代謝能力外，也面臨更強(qiáng)烈的病原菌脅迫，因而對(duì)病原菌（尤其是沙門氏菌）具有更高的免疫反饋。
3、結(jié)論
①VEL中蚯蚓脂肪酸含量會(huì)增加以適應(yīng)濾池及剩余污泥環(huán)境，但與抑菌免疫無直接關(guān)聯(lián)；VECF較CECF表現(xiàn)出更明顯的抑制作用，結(jié)合VF對(duì)病原菌的去除效果，認(rèn)為VECF對(duì)剩余污泥中沙門氏菌、大腸桿菌的去除具有直接貢獻(xiàn)，但對(duì)金黃色葡萄球菌的去除貢獻(xiàn)不顯著，VF對(duì)金黃色葡萄球菌的去除機(jī)理有待進(jìn)一步探究；VEL抑菌水平明顯弱于VECF，即體腔液對(duì)蚯蚓免疫發(fā)揮主要作用。
②通過蛋白質(zhì)組分析得出，濾池蚯蚓提高了分子質(zhì)量在3~10、10~30ku范圍的抑菌蛋白表達(dá)。當(dāng)前蚯蚓體腔液中抗菌肽的研究表明，大多數(shù)已分離的蚯蚓抗菌肽分子質(zhì)量30ku四個(gè)范圍。iTRAQ蛋白質(zhì)組的鑒定結(jié)果表明，蚯蚓體腔液中含有較多分子質(zhì)量>30ku的蛋白質(zhì)，對(duì)大于30ku的不同分子質(zhì)量范圍蛋白的抑菌作用有待進(jìn)一步試驗(yàn)確定，未來可進(jìn)行更加深入的研究。（來源：同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海市城市建設(shè)設(shè)計(jì)研究總院<集團(tuán)>有限公司）
