隨著納米科技的迅猛發(fā)展，各類新型的人工納米材料（NMs）不斷涌現(xiàn)。然而，在給生活帶來便利和創(chuàng)造經(jīng)濟價值的同時，NMs的安全性和生物效應成為備受關注的焦點問題。污水處理廠作為多種環(huán)境污染物的最終受體，勢必會有越來越多的NMs經(jīng)由工業(yè)、農(nóng)業(yè)活動和市政污水管網(wǎng)等多種途徑進入污水處理廠。
進入污水處理系統(tǒng)中的NMs會被活性污泥或生物膜等微生物聚集體吸附并與之發(fā)生相互作用。一方面，微生物聚集體表面復雜的微環(huán)境會影響NMs的環(huán)境行為和理化性質，進而改變其對微生物聚集體的毒性作用。另一方面，與微生物聚集體接觸的NMs也會直接或者間接地對微生物聚集體產(chǎn)生影響：一是直接與微生物聚集體相對外層的胞外聚合物（EPS）發(fā)生作用，造成其含量、組成和物化特性的變化；二是給相對內(nèi)層的微生物細胞帶來影響，引起群落結構的變化；三是對微生物聚集體最為重要的功能屬性——凈污特性產(chǎn)生影響。上述影響最終可能會帶來微生物聚集體表面性能的變化，從而引起污水處理系統(tǒng)運行效率的降低，造成污水廠出水水質變差。
1、微生物聚集體對NMs環(huán)境行為的影響
1.1 對NMs遷移轉化及其毒性的影響
微生物聚集體是由覆蓋在微生物表面的EPS通過橋接作用將各種微生物聚集在一起而形成的巨大的三維結構，其在污染物的截留、維持污水處理系統(tǒng)的穩(wěn)定運行中發(fā)揮了重要作用。由于微生物聚集體具有良好的吸附性能，NMs進入污水處理系統(tǒng)后，90%以上的NMs（少數(shù)性質特殊而難以吸附的除外）通過靜電作用、配位作用、氫鍵作用等方式被吸附、截留在微生物聚集體中。尺寸較小的NMs可以由細胞膜表面的小孔或破損處進入細胞，尺寸較大的NMs可以通過胞吞作用進入細胞。類似地，金屬NMs溶出的相應金屬離子可以由特定的離子通道進入細胞內(nèi)部。微生物聚集體對NMs的吸附、內(nèi)化作用以及NMs在其表面或內(nèi)部發(fā)生的一系列轉化過程對描述NMs的生物毒性具有重要的指導意義。例如，Ag、Fe、ZnO、CuO、TiO2等納米顆粒（NPs）會通過接觸損傷、遮蔽效應等對微生物聚集體產(chǎn)生直接或間接的毒性效應。因而，人工納米材料在微生物聚集體中的分布和轉化對其生態(tài)風險評價尤為關鍵。
由于微生物聚集體中復雜而多變的微環(huán)境，NMs在與微生物聚集體接觸后，還會發(fā)生氧化、還原、硫化、絡合等一系列化學反應。例如，由于CeO2-NPs獨特的儲-釋氧能力，其在微生物聚集體表面的微還原環(huán)境下會發(fā)生Ce（Ⅳ）與Ce（Ⅲ）的相互轉化，并伴隨自由基的生成和細胞氧化損傷的出現(xiàn)。磷及其化合物是微生物聚集體不可或缺的組成元素之一，廣泛存在于DNA、脂類、細胞膜等分子或結構中。人工納米材料在進入細胞的過程中，首先會接觸到細胞膜，進而與細胞膜中的磷脂雙分子層發(fā)生作用。研究發(fā)現(xiàn)，稀土氧化物CeO2-NPs與磷脂雙分子層的反應會將磷酸根從其組成結構中剝離出來，進一步引起細胞器損傷。微生物聚集體中的磷酸基團還可以與ZnO-NPs和CeO2-NPs反應生成穩(wěn)定的絡合物。此外，納米材料進入細胞內(nèi)部后會與細胞內(nèi)的蛋白、氨基酸等生物分子發(fā)生特異性的結合。例如，CuO-NPs會與生物膜細胞中的半胱氨酸結合并形成穩(wěn)定的結構，進而破壞微生物細胞的生理代謝功能。硫化作用是環(huán)境中納米材料的一個重要轉化過程和潛在的解毒機制，特別是在低氧或者厭氧污水處理條件下，金屬和金屬氧化物NMs會與硫離子發(fā)生反應。Ma等在中試污水處理廠中發(fā)現(xiàn)，ZnO-NPs和Ag-NPs在微生物聚集體的還原性作用下最終轉化為穩(wěn)定的ZnS和Ag2S。類似地，Cd-NPs和CeO2-NPs在含硫的厭氧生物體系下也會轉化生成CdS和Ce2S3。在微生物聚集體的作用下，金屬硫化物的形成導致金屬NPs溶解釋放的離子量進一步下降，同時形成的硫化物沉淀并附著在NPs的表面，進而降低NPs的生物毒性。
上述研究結果表明，微生物聚集體的吸附、還原特性及生物組成成分對NPs的穩(wěn)定性具有明顯的影響，而NPs穩(wěn)定性的變化與其毒性效應息息相關。因此，目前階段針對污水生物處理系統(tǒng)中NPs的遷移轉化行為及生物毒性效應研究難以得出一致的結論。在接下來的研究中，從NPs的材料特性、微生物聚集體的表面與功能特性、環(huán)境影響因素三個方面入手，分析NPs遷移轉化過程的驅動因素是進一步揭示其毒性變化的關鍵。
1.2 EPS對NMs賦存及毒性效應的影響
EPS是由微生物自身分泌的高分子物質、細胞裂解產(chǎn)物和吸附的外界高分子有機物形成的，以松散EPS（LB-EPS）或緊密結合態(tài)EPS（TB-EPS）形式包裹在細胞表面的水凝膠層。作為微生物的物理保護屏障，當遇到有毒性效應的NPs時，微生物會分泌更多的EPS來抵抗納米毒性。一方面增加的EPS可以促進NPs的團聚，增加其水力學直徑，從而降低NPs進入細胞內(nèi)部的幾率，減輕NPs的毒性影響；另一方面，EPS中的兩性分子和無機基團（如硫酸基、磷酸基等）可以吸附水體中的NPs或其釋放的金屬離子，保護細胞免受外部的毒性影響；再一方面EPS除阻擋NPs入侵外，還可能對NPs進行包覆，進一步增加其向細胞內(nèi)部運移的阻力。EPS在調控微生物聚集體應對納米毒性中發(fā)揮的作用及相關組成成分見表1。
研究表明，EPS可以通過絡合、無機沉淀、離子交換、還原等方式與NPs相互作用，進而影響NPs對微生物的毒性作用，常用分析方法和檢測手段如表2所示。具體來說，EPS內(nèi)常常含有多糖、蛋白質、核酸、磷脂、褐藻酸、腐殖酸等有機質，因而可以對NPs產(chǎn)生與生物膜類似的化學吸附作用。進一步利用透射電子顯微鏡結合熒光顯微滴定分析和傅里葉變換紅外光譜分析表明，EPS中的蛋白類物質和羧酸中的二級羰基、多糖是主要的結合位點。已有研究表明，被吸附在微生物聚集體中的人工納米材料，部分被截留在相對表層的LB-EPS和TB-EPS中，部分附著在細胞的表面，剩余的極少部分進入細胞的內(nèi)部。例如，Xu等發(fā)現(xiàn)98%的CeO2-NPs進入SBBR反應器后被截留在EPS中或附著在細胞表面，很少一部分進入細胞內(nèi)部。
上述EPS對NPs的吸附截留作用對保護細胞結構和生理活性免受納米脅迫的影響具有重要作用。此外，由于原子排列以及電荷穩(wěn)定的作用，EPS中的蛋白質、腐殖酸、富里酸等具有減弱NPs聚集和沉降的傾向；而由于架橋作用，多聚糖類物質往往會促進NPs的沉降。利用動態(tài)光散射和石英晶體微天平研究發(fā)現(xiàn)，EPS中的小分子可以使ZnO-NPs的表面Zeta電位由正值變?yōu)樨撝担瑥亩鴾p少ZnO-NPs在污泥細胞表面的吸附量，進而降低對活性污泥的毒害作用。對于零價鐵納米顆粒（ZVI-NPs），EPS對其理化性質的影響在調控其毒性中發(fā)揮著重要的作用。一方面，EPS表面帶負電的官能團對ZVI-NPs的吸附作用增加了微生物細胞與ZVI-NPs的接觸機會，導致細胞受到損傷，但這種損傷并不能直接致死，在合適的條件下微生物可以實現(xiàn)自我修復；另一方面，EPS吸附ZVI-NPs后促進了ZVI的腐蝕，產(chǎn)生了低毒性的鐵氧化物，降低了其對微生物的毒性。
綜上所述，在不同生物體系下，EPS對不同種類NPs的賦存和轉化的影響在緩解NPs生物效應方面具有重要作用，因此探明NMs在微生物聚集體EPS中的原位分布規(guī)律和環(huán)境行為，對闡明其“老化”過程、揭示其毒性作用機理、緩解其環(huán)境影響至關重要。但受限于檢測技術和方法，實際僅能夠檢測到元素總量，而難以鑒別納米級別的含量和分布。
2、NMs對微生物聚集體的影響
2.1 對微生物聚集體中EPS組成與特性的影響
微生物聚集體的表面往往帶有許多基團，而納米材料由于本身尺寸微小、質量較輕，很容易成為微生物聚集體吸附的對象。Geyik等研究Ag-NPs對活性污泥的影響時發(fā)現(xiàn)，Ag-NPs可以與LB-EPS及TB-EPS結合且結合能力與EPS的分子質量分布有關，結合后的Ag-NPs會對EPS的吸附點位和性質產(chǎn)生影響。類似地，暴露于石墨烯類材料后，EPS的光譜性能和組成結構發(fā)生了明顯改變，其中蛋白類的組成變化最大。進一步，楊曉南發(fā)現(xiàn)，TiO2-NPs會與蛋白組成中的疏水氨基酸發(fā)生結合，從而引起EPS中蛋白熒光譜圖的紅移。此外，外加TiO2-NPs后，污泥表面EPS中的蛋白質和多糖降解成小分子的能力有所提高，而膜生物反應器在應對外加TiO2-NPs的毒性時，微生物聚集體的EPS中含有更多的脂肪酸和膽固醇。上述TiO2-NPs對EPS組成及含量的影響會進一步影響微生物聚集體的表面電荷、表面形貌和表面張力。同時，高濃度的TiO2-NPs會顯著降低微生物聚集體中蛋白質和多糖的含量，主要是因為微生物聚集體表面覆蓋了大量TiO2-NPs，阻礙外界營養(yǎng)物質向內(nèi)部的輸移，導致微生物細胞活性降低，從而引起蛋白質和多糖含量的減少。在生物膜系統(tǒng)中，CeO2-NPs短期和長期暴露對EPS組成及空間分布會產(chǎn)生明顯的影響。短期暴露后，生物膜表面EPS中多糖和蛋白質的含量明顯增加、腐殖酸含量降低、EPS的官能團和絮凝效率受到影響；長期暴露后，EPS中多糖含量增加而蛋白質含量基本不變、TB-EPS中高表觀分子質量的相對占比增加、乙�；教岣�，蛋白質二級結構中（α-螺旋+3-反螺旋）/β-折疊比值增加。因此，微生物聚集體主要通過改變生理代謝水平進而調節(jié)其表面EPS含量和組成的變化，以適應并響應CeO2-NPs引起的不利影響。
EPS組成、含量的變化勢必會進一步引起微生物聚集體空間結構和表面性能的變化。相比于未添加TiO2-NPs的絮體，暴露于TiO2-NPs后的活性污泥絮體中EPS減少，其表面呈現(xiàn)出不同程度的粗糙度，并給體系的穩(wěn)定性和絮凝性能帶來影響。然而，也有學者研究發(fā)現(xiàn)暴露于碳納米管的顆粒污泥會分泌更多的EPS，使得污泥表面更加密實平整；進一步利用激光共聚焦掃描顯微鏡結合顯色分析對其內(nèi)部EPS的分布進行原位觀測發(fā)現(xiàn)，在原始的顆粒污泥中蛋白質和多糖分布均勻，支撐起整個污泥的空間結構；而添加碳納米管后，多糖和蛋白質主要聚集在顆粒污泥的外層，這將有助于顆粒污泥抵抗納米毒性。在序批式生物反應器內(nèi)，經(jīng)不同濃度的CeO2-NPs短期暴露，活性污泥的沉降性能基本不變，但絮凝和團聚效率隨CeO2-NPs濃度的增加而下降、出水濁度升高，水質變差。此外，不同濃度的CeO2-NPs暴露對活性污泥流變性的影響不同：在低濃度CeO2-NPs短期暴露條件下，活性污泥的表觀黏度降低、流動性增強，這與細菌活性的變化有關；而在高濃度CeO2-NPs暴露條件下，污泥表觀黏度增大、彈性行為增強，表現(xiàn)出更多與固體相似的性質，該結果與EPS分泌量增加、微生物聚集體表面結構更加密實有關。上述研究表明，微生物聚集體可以通過改變其結構和性質來應對CeO2-NPs的毒性效應。
2.2 對微生物聚集體中微生物群落結構的影響
在微生物聚集體中，由于EPS包裹在微生物細胞表面，各營養(yǎng)要素在不同深度處形成濃度梯度，在空間上形成協(xié)同共生的復雜多群落結構。Miao等開展CuO-NPs對污水生物膜的毒性研究時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CuO-NPs暴露后生物膜內(nèi)微生物多樣性水平增加，微生物群落結構發(fā)生變化，具體表現(xiàn)為：變形菌門和產(chǎn)酸菌門的比例升高，擬桿菌門占比降低；更進一步在屬水平發(fā)現(xiàn)，對重金屬具有抗性的叢毛單胞菌屬豐度增加，與生物絮凝相關的動膠菌屬豐度降低。經(jīng)CeO2-NPs暴露后，對污水生物膜脫氮過程中微生物群落結構的影響研究發(fā)現(xiàn)，與氨氧化過程相關的Rhodoferax和Pseudoclavibacter豐度降低；與硝化過程相關的Devosia和Salinibacterium的豐度增加，而Nitrospira的豐度降低；與反硝化過程相關的Citrobacter、Simplicispira、Dechloromonas和Zoogloea豐度增加；群落結構的變化可能與CeO2-NPs引起的生物膜內(nèi)部溶解氧、pH和氧化還原電勢的變化相關。同樣地，CeO2-NPs也會改變生物膜除磷過程中微生物的群落結構。經(jīng)CeO2-NPs暴露后，與好氧聚磷密切相關的Burkholderia的豐度大幅降低；而與厭氧釋磷相關的Rhodocyclaceae和Comamonadaceae豐度卻有所增加，這很可能與不同菌群在生物膜中所處的位置深度有關。對于厭氧系統(tǒng)中，Li等發(fā)現(xiàn)碳納米管提高了厭氧微生物活性，增加了產(chǎn)甲烷古菌Methanosaetaconcilii以及與揮發(fā)性脂肪酸發(fā)酵相關的Clostridium菌群的豐度。He等發(fā)現(xiàn)外加ZVI-NPs后，厭氧產(chǎn)甲烷體系中與糖酵解及酸化產(chǎn)甲烷相關的細菌出現(xiàn)減少，而氫營養(yǎng)型的產(chǎn)甲烷菌明顯增加，說明外加ZVI-NPs產(chǎn)生的H2通過強化氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑促進了甲烷的產(chǎn)生。在自然水體生物膜和底泥沉積物生物膜中，人工納米材料的存在同樣會改變微生物的群落結構。Cardinale等報道稱TiO2-NPs對衣藻、小球藻和柵藻的生長抑制率不同，從而改變生物膜中附著藻類群落的相對組成；Miao等發(fā)現(xiàn)TiO2-NPs和CeO2-NPs會顯著降低表層沉積物中噬甲基菌屬、噬纖維菌屬和藍藻細菌的菌群數(shù)量，進而對沉積物表層生物的好氧代謝過程產(chǎn)生抑制作用。以上研究結果顯示，在活性污泥、生物膜以及厭氧發(fā)酵生物系統(tǒng)中，不同的群落組成和空間分布使其對不同NPs的毒性響應結果有所不同，各功能菌的豐度和結構變化各異。
盡管已有研究探究了大量有關不同暴露形式和暴露背景下，NPs對微生物聚集體內(nèi)功能微生物豐度、組成及功能的影響，但是不同的微生物聚集結構和代謝方式導致其內(nèi)部好氧、兼氧及厭氧微生物縱向分布區(qū)域和空間微環(huán)境不同，進而造成其與NPs的接觸方式及接觸的量也不盡相同，導致目前已有研究難以得出一致的結論。因此，在下一步研究中應充分考慮不同生態(tài)系統(tǒng)中微生物聚集體與NPs相互作用過程的理化特征，以得出普適性的功能微生物對NPs生物毒性的響應規(guī)律。該響應規(guī)律對于指導如何調控生物系統(tǒng)應對納米毒性風險、降低NPs的生態(tài)毒性沖擊具有重要意義。
2.3 對微生物聚集體凈污活性的影響
微生物聚集體（特別是在人工強化的污水處理系統(tǒng)內(nèi)）往往含有豐富的硝化菌、反硝化菌以及聚磷菌等功能細菌，它們在污染物的降解去除和水體的凈化過程中發(fā)揮著重要作用。人工納米材料的毒性作用會抑制功能菌的生長，從而影響微生物聚集體的凈污活性，相關研究結果如表3所示。
鄭雄的研究結果表明，在活性污泥反應器中，50mg/L的ZnO-NPs就可抑制活性污泥的脫氮除磷效率，使得總氮的去除率從81.5%降至70.8%；出水溶解性磷的濃度從0.1mg/L以下升至16.5mg/L；而Al2O3-NPs、SiO2-NPs和TiO2-NPs對污水生物硝化、反硝化以及除磷過程均沒有顯著影響。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)10mg/L的CeO2-NPs暴露后，生物膜反應器中氮、磷的去除率受到明顯抑制。生物脫氮除磷過程中關鍵酶的活性對去除效果起到了決定性作用。例如，50mg/L的ZnO-NPs不會影響活性污泥中氨單加氧酶和亞硝酸鹽氧化還原酶的活性，但會抑制與反硝化過程相關的硝酸根還原酶的活性，從而導致出水NO3--N濃度顯著增加；同時，50mg/L的ZnO-NPs還會抑制活性污泥外切聚磷酸酶和多磷酸鹽激酶的活性，導致活性污泥厭氧釋磷量和低氧吸磷量的顯著降低。
為了更加深入地探尋人工納米材料對微生物脫氮除磷的抑制機理，進一步利用基因轉錄水平對微生物的功能開展研究，結果發(fā)現(xiàn)經(jīng)ZnO-NPs暴露后，P.denitrificans中基因的表達出現(xiàn)顯著性差異，上調的有556個，下調的有1158個；轉錄上調的基因主要與PHB合成、丙酮酸代謝和胞內(nèi)抗氧化作用等途徑相關；與糖酵解過程相關基因的表達都出現(xiàn)了顯著下調；而與硝酸鹽代謝密切相關的nitratereductase（EC1.7.1.1）、nitratereductase1、nitritereductase（EC1.7.2.1）和nitricoxidereductase（EC1.7.99.7）等基因表達水平的降低可能是脫氮效率受抑制的重要原因。
在微生物聚集體中，除了微生物的代謝作用對污染物去除具有顯著影響外，營養(yǎng)物質向胞內(nèi)的擴散阻力勢必也會影響聚集體的凈污效果，而該擴散阻力主要是由EPS含量及特性的變化所調控。已有研究表明，向水中加入納米顆粒形成的納米流體會強化氣液傳質過程。在污水生物膜體系中，You等發(fā)現(xiàn)投加10mg/L的CeO2-NPs強化了氣-液界面的傳質能力，降低了氣-液邊界層的厚度，使得氣-液邊界層的傳質效率增大；但是經(jīng)CeO2-NPs暴露后，生物膜表面凹凸多孔的結構變?yōu)楦泳鶆蚱秸拿軐嵔Y構，生物膜的表面積差異度減小，使得生物膜表面液-膜邊界層的厚度增加，液-膜界面的傳質能力降低。進一步對微生物活性及EPS特性進行分析發(fā)現(xiàn)，升高的EPS含量增大了膜內(nèi)傳質阻力。綜合來看，受NPs影響，EPS含量及特性變化對微生物聚集體的凈污活性具有多重影響。一方面EPS具有良好的吸附性能，其含量增加會促進部分污染物的富集去除；另一方面，增加的EPS會降低污染物向微生物細胞的傳質效率，進而降低污染物的生物降解水平。因此，考慮NPs對微生物聚集體EPS特性及傳質性能的影響，綜合評價微生物聚集體凈污活性的變化有待進一步深入研究。
目前，NPs對污水處理系統(tǒng)內(nèi)微生物聚集體凈污活性的影響研究多關注于脫氮除磷效率的變化，而對有機物或新污染物的降解效率、去除過程的影響及機制研究還較少。此外，已有研究中NPs的濃度梯度設置跨度較大，忽略了NPs暴露濃度逐漸增加時微生物聚集體的適應性響應過程，而這一過程將影響微生物聚集體對NPs的抵抗能力，該現(xiàn)象對評估污水處理系統(tǒng)內(nèi)動態(tài)累積的NPs的生態(tài)風險、明確NPs長期暴露下污水處理系統(tǒng)的運行穩(wěn)定性具有重要意義。今后，利用蛋白質組學或宏基因組學揭示微生物聚集體對NPs暴露的響應機制有望為研發(fā)納米CeO2毒性效應的緩解措施提供科學依據(jù)。
3、結語
目前，有關NPs在污水處理系統(tǒng)內(nèi)的遷移轉化、賦存規(guī)律及生物效應研究已經(jīng)進入了一個全新的階段，在幾乎明確了納米金屬與其氧化物在污水處理系統(tǒng)內(nèi)的環(huán)境行為與生物作用機制后，下一步應更加深入、全面地了解NPs與污水微生物聚集體的相互作用及環(huán)境影響。
①盡管已有研究充分揭示了微生物聚集體及其表面EPS對NPs理化性質的影響，但不同實驗背景下得到的研究結果往往不一致。因此，進一步考慮NPs的材料特性、聚焦微生物對EPS響應過程的調控作用，對闡明NPs的環(huán)境行為與生物效應具有重要意義。
②盡管已有研究系統(tǒng)地揭示了納米材料對污水微生物聚集體的脅迫作用，但有關如何恢復受損微生物活性的研究還非常有限。因此，從微生物群落結構變化、修復基因的富集和表達等方面探究微生物抵抗和恢復機制對維持污水處理系統(tǒng)的正常生態(tài)功能具有重要意義。（來源：河海大學環(huán)境學院淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點實驗室，河海大學農(nóng)業(yè)科學與工程學院）
