1 引言

　　水質(zhì)基準(zhǔn)是制定水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)依據(jù)，目前針對(duì)我國(guó)水域的水質(zhì)基準(zhǔn)研究較少，我國(guó)現(xiàn)行水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)國(guó)外水質(zhì)基準(zhǔn)數(shù)值確定，但水質(zhì)狀況與生物區(qū)系的不同會(huì)造成水質(zhì)基準(zhǔn)的明顯差異.因此，依據(jù)我國(guó)國(guó)情開(kāi)展水質(zhì)基準(zhǔn)研究已經(jīng)成為我國(guó)水環(huán)境管理的迫切需求.

　　菲(Phenanthrene，PHE)，是多環(huán)芳烴中最具代表性的物質(zhì)之一，屬于內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，由于它被廣泛應(yīng)用于合成樹(shù)脂、農(nóng)藥、染料、醫(yī)藥、防霉劑和鞣料等工業(yè)里，因此在空氣、水體、土壤和動(dòng)植物體內(nèi)的檢出率較高.目前在國(guó)內(nèi)外許多水體中都曾檢測(cè)出菲，如美國(guó)新澤西州河口PilesCree水域中菲含量為80~800 ng·g-1，尼日利亞Siokolo島水域中菲含量為1.46 μg·mL-1.有研究顯示，菲對(duì)雙殼貝類、甲殼類、魚類、水生昆蟲等動(dòng)物都有潛在的毒性，原因是菲結(jié)構(gòu)中的9、10雙鍵具有高電子密度，易與細(xì)胞內(nèi)的DNA、RNA等物質(zhì)結(jié)合而引起致毒作用，并且菲的結(jié)構(gòu)中還具有與致癌性相關(guān)的K區(qū)(K-region)和灣區(qū)(bayregion).通過(guò)開(kāi)展菲的水生生物基準(zhǔn)閾值研究，可以填補(bǔ)我國(guó)本土水生生物菲的生態(tài)毒性數(shù)據(jù)空白，為我國(guó)菲的水生生物基準(zhǔn)建立、環(huán)境管理工作提供技術(shù)支持.

　　本研究根據(jù)我國(guó)淡水生物區(qū)系特征綜合考慮物種篩選原則及影響因素，同時(shí)結(jié)合美國(guó)的水質(zhì)基準(zhǔn)“指南”中“三門八科”最低毒性數(shù)據(jù)要求，選擇具有代表性的“四門八科”9種本土水生生物(錦鯉、麥穗、泥鰍、澤蛙蝌蚪、大型溞、青蝦、搖蚊幼蟲、霍甫水絲蚓和水螅屬)進(jìn)行生態(tài)毒理學(xué)急性和慢性實(shí)驗(yàn)，在推導(dǎo)出菲本土水生生物基準(zhǔn)閾值的同時(shí)，與美國(guó)水生生物已報(bào)道毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行本土與美國(guó)物種毒性敏感度分析比較，探究非美國(guó)水生生物毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行我國(guó)本土水生生物基準(zhǔn)研究的可行性.

　　2 材料與方法 2.1 實(shí)驗(yàn)材料

　　學(xué)術(shù)界一般認(rèn)為，魚類、浮游生物、底棲動(dòng)物和植物可表征復(fù)雜水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)特征和功能.按照美國(guó)水質(zhì)基準(zhǔn)“指南”中“三門八科”最低毒性數(shù)據(jù)要求，參照《中國(guó)脊椎動(dòng)物大全》(李明玉等，2000)和《中國(guó)生物多樣性國(guó)情研究報(bào)告》(國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局，1998)等文獻(xiàn)資料，我國(guó)水質(zhì)基準(zhǔn)推導(dǎo)的試驗(yàn)生物基本可采用“指南”規(guī)定的物種選擇原則，但必須包括鯉科魚類;另外由于我國(guó)鯉科數(shù)量龐大，因此本文選用兩種鯉科魚.根據(jù)我國(guó)淡水生物區(qū)系特征，結(jié)合美國(guó)和歐盟推導(dǎo)水質(zhì)基準(zhǔn)的物種選擇，初步確定了菲基準(zhǔn)研究所需本土生物物種，分別是脊索動(dòng)物門鯉科(錦鯉、麥穗魚)、鰍科(泥鰍)、蛙科(澤蛙蝌蚪)，節(jié)肢動(dòng)物門溞科(大型溞)、蝦科(青蝦)、搖蚊科(搖蚊幼蟲)，環(huán)節(jié)動(dòng)物門顫蚓科(霍甫水絲蚓)，腔腸動(dòng)物門水螅蟲科(水螅屬)，共“四門八科”9種本土水生動(dòng)物.另外，本研究系統(tǒng)全面的搜集了菲的水生植物毒性數(shù)據(jù)，但滿足毒性數(shù)據(jù)篩選原則(US EPA，1985)的數(shù)據(jù)十分匱乏，僅搜集到浮萍(Lemna minor)的LC50數(shù)據(jù)，本研究選用此數(shù)據(jù)進(jìn)行基準(zhǔn)閾值推導(dǎo).

　　9種本土水生動(dòng)物購(gòu)自朝來(lái)春及大森林水產(chǎn)市場(chǎng)，正式試驗(yàn)前均在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)至少7 d;大型溞(Daphnia magna)，溞齡 < 24 h，由中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供.水生生物培養(yǎng)條件為：pH為8.0±0.2，DO為(8.3±0.3) mg·L-1，溫度為(22±2) ℃，試驗(yàn)類型采用換水式，每24 h換1次水，急性試驗(yàn)不喂食，慢性試驗(yàn)按照0.1%生物質(zhì)量1 d喂食兩次;溞類光照周期為12 h:12 h.

　　受試物種選擇依據(jù)如下：當(dāng)受試物種為水溞或其他水溞類動(dòng)物時(shí)，應(yīng)使用齡期小于24 h的生物進(jìn)行試驗(yàn);當(dāng)受試物種為蚊類時(shí)，應(yīng)使用其第2代或第3代幼蟲進(jìn)行試驗(yàn);當(dāng)受試物種為魚類或其他物種時(shí)，應(yīng)使用幼齡期的生物(至少要先于性腺發(fā)育前60 d)進(jìn)行試驗(yàn).

　　實(shí)驗(yàn)用菲，C14H10，純度≥98%(HPLC), 為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich化學(xué)品公司;其他試劑均為分析純.全部玻璃器具使用前經(jīng)過(guò)高價(jià)酸液沖洗之后由氣相色譜分析從而保證不會(huì)產(chǎn)生干擾，同時(shí)操作過(guò)程中實(shí)驗(yàn)員嚴(yán)格遵守操作規(guī)定.菲溶液配制使用的移液槍經(jīng)中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院校準(zhǔn)，各個(gè)濃度組第一次實(shí)驗(yàn)前由氣相色譜檢測(cè)確保濃度配制精準(zhǔn).在3組空白實(shí)驗(yàn)中加入內(nèi)標(biāo)菲-d10，96 h后測(cè)定其回收率，結(jié)果顯示，菲-d10的回收率為74.3%~89.6%，滿足70%~130%的US EPA(1985)公布的回收率要求，證明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠準(zhǔn)確.

　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法

　　急性實(shí)驗(yàn)按照美國(guó)材料與試驗(yàn)協(xié)會(huì)(American Society for Testing and Materials，ASTM)標(biāo)準(zhǔn)方法執(zhí)行，設(shè)空白對(duì)照組、助溶劑(二甲基亞砜, DMSO)對(duì)照組、濃度組，每組3個(gè)重復(fù).溞類急性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行48 h，其余8種水生生物要進(jìn)行96 h;相關(guān)信息見(jiàn)表 1.

 　　慢性實(shí)驗(yàn)根據(jù)菲對(duì)錦鯉、泥鰍和大型溞的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，空白對(duì)照組、助溶劑(二甲基亞砜, DMSO)對(duì)照組、濃度組，每組3個(gè)重復(fù).其中最高濃度組低于急性毒性LC50值.采用靜態(tài)更新試液法，每隔1 d更新1次受試液并喂食.錦鯉、泥鰍慢性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至少28 d以上，溞類至少21 d以上，具體實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置如下：錦鯉為0.00、0.35、0.46、0.60、0.78、1.01和1.32 mg·L-1 PHE;泥鰍為0.00、0.42、0.55、0.72、0.94、1.22和1.59 mg·L-1PHE;大型溞為0.00、0.42、0.55、0.72、0.94、1.22和1.59 mg·L-1 PHE.試驗(yàn)中每天記錄錦鯉和泥鰍體長(zhǎng)、體重等生長(zhǎng)指標(biāo)，記錄大型蚤第一窩產(chǎn)卵時(shí)間、數(shù)量，總產(chǎn)卵窩數(shù)量和總產(chǎn)卵數(shù)量等.

　　2.3 數(shù)據(jù)搜集與分析

　　通過(guò)US EPA ECOTOX毒性數(shù)據(jù)庫(kù)、ELSEVIER數(shù)據(jù)庫(kù)和CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)等進(jìn)行數(shù)據(jù)搜集.篩選原則如下：①測(cè)試信息不完全、信息保密、受權(quán)限或其他原因不能傳播的數(shù)據(jù)不得使用;②具有高度揮發(fā)性、易水解或降解的物質(zhì)，一般只有流水式試驗(yàn)的結(jié)果可以使用;③測(cè)試終點(diǎn)為慢性NOEC或LOEC值，優(yōu)先使用NOEC值;④一些有問(wèn)題或有疑點(diǎn)的數(shù)據(jù)(如：沒(méi)有設(shè)立對(duì)照組、試驗(yàn)生物曾經(jīng)暴露于污染物、試驗(yàn)設(shè)計(jì)不科學(xué)的數(shù)據(jù))均不能采用.

　　另外，在獲得毒性數(shù)據(jù)后，首先應(yīng)該對(duì)數(shù)據(jù)或?qū)��?shù)轉(zhuǎn)換的毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，一般采用K-S檢驗(yàn)或者t檢驗(yàn).本研究選用K-S檢驗(yàn)(Two-sample Kolmogorov-Smirnov)PHE美國(guó)水生生物毒性數(shù)據(jù)(表 2)的正態(tài)分布，結(jié)果顯示，p=0.08>0.05，認(rèn)為美國(guó)水生生物毒性數(shù)據(jù)對(duì)PHE毒性敏感的總體分布基本相同，符合正態(tài)分布.

 　　EC/LCx計(jì)算方法：EC/LCx和95%置信區(qū)間采用概率單位直線回歸法計(jì)算，急性毒性試驗(yàn)x為50，慢性毒性實(shí)驗(yàn)x為10.試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束后溶液中PHE濃度檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)測(cè)和名義濃度比率在91.68%~103.47%之間，即濃度差異在20%以內(nèi)，符合測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)對(duì)濃度的要求(Aldenberg et al., 2000)，因此本文中濃度采用名義濃度計(jì)算EC/LCx.

　　3 結(jié)果與分析 3.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

　　9種本土水生生物的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 3，空白對(duì)照組和助溶劑對(duì)照組均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象.結(jié)果顯示水螅屬的96 h LC50為0.096 mg·L-1，水螅屬對(duì)PHE暴露的敏感性最高，其次是大型溞、搖蚊幼蟲、麥穗魚、澤蛙蝌蚪、霍甫水絲蚓、青蝦和錦鯉，對(duì)PHE最不敏感的是泥鰍，其96 h LC50為3.684 mg·L-1.

 　　本文也進(jìn)行了PHE對(duì)美國(guó)水生生物毒性的對(duì)比，前人研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)鰓太陽(yáng)魚、虹鱒和大鱗大麻哈魚的96 h LC50為0.234、0.375和0.478 mg·L-1 PHE，這和本文的試驗(yàn)結(jié)果比較接近.同時(shí)本文研究得到的浮游甲殼類水生生物大型溞96 h LC50為0.275 mg·L-1，這與前人研究的另外一種浮游甲殼類生物蚤狀溞(0.350 mg·L-1)也極為接近.本研究中本土底棲甲殼類生物青蝦96 h LC50為1.079 mg·L-1，而美國(guó)底棲甲殼類生物俄勒岡蝦96 h LC50為0.027 mg·L-1，兩者之間相差了40倍左右;環(huán)節(jié)動(dòng)物之間同樣存在著較顯著差異，本土霍甫水絲蚓96 h LC50為0.799 mg·L-1，美國(guó)夾雜帶絲蚓對(duì)PHE毒性更加敏感，96 h LC50為0.419 mg·L-1.由于缺乏相應(yīng)的毒性數(shù)據(jù)，因此本文未進(jìn)行昆蟲類及兩棲類對(duì)比.

　　3.2 慢性毒性數(shù)據(jù)

　　對(duì)于慢性毒性數(shù)據(jù)(表 4)，Call等報(bào)道稱大型溞的存活率21 d NOEC為0.163 mg·L-1，與本試驗(yàn)中大型溞總繁殖數(shù)量的21 d EC10(0.060 mg·L-1)處在一個(gè)數(shù)量級(jí)之內(nèi).同時(shí)所有試驗(yàn)濃度組中均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，表中可見(jiàn)大型溞對(duì)PHE暴露的繁殖總數(shù)試驗(yàn)終點(diǎn)要比存活率更為敏感.本試驗(yàn)中錦鯉和泥鰍生長(zhǎng)的28 d EC10分別為0.435和0.540 mg·L-1 PHE，前人研究發(fā)現(xiàn)PHE對(duì)虹鱒生長(zhǎng)的28 d NOEC分別為0.66 mg·L-1.在慢性毒性試驗(yàn)中，大型溞仍然是對(duì)PHE暴露最敏感的物種.

 　　3.3 基于本土與美國(guó)生物毒性數(shù)據(jù)擬合SSD曲線比較

　　Davies等提出“靈活使用毒性數(shù)據(jù)”的設(shè)想，即使用一個(gè)地區(qū)的生物毒性數(shù)據(jù)去進(jìn)行另一個(gè)區(qū)域的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估.不過(guò)該設(shè)想提出后受到多方面質(zhì)疑，因?yàn)椴煌�地區(qū)水溫、水中溶解氧濃度不同，而且不同種類生物對(duì)同一有害物質(zhì)的敏感性也存在差異(Hose et al., 2007).本研究針對(duì)本土(表 2)與美國(guó)(表 3)生物毒性數(shù)據(jù)擬合的SSD曲線進(jìn)行比較，從而初步探索“靈活使用毒性數(shù)據(jù)”設(shè)想的可行性.由于慢性數(shù)據(jù)相對(duì)匱乏，因此本研究?jī)H使用急性毒性數(shù)據(jù).本研究針對(duì)PHE毒性數(shù)據(jù)共擬合出3條SSD曲線，分別是本土生物毒性數(shù)據(jù)(黑線)、美國(guó)生物毒性數(shù)據(jù)(紅線)及本土+美國(guó)生物全部毒性數(shù)據(jù)(藍(lán)線).如圖 1所示，由左向右分別是美國(guó)數(shù)據(jù)、總體數(shù)據(jù)及本土數(shù)據(jù)，這意味著美國(guó)相對(duì)于本土生物對(duì)PHE暴露表現(xiàn)出更加敏感的趨勢(shì).經(jīng)過(guò)計(jì)算，3條曲線的HC5值分別是0.0780、0.0785及0.0854 mg·L-1.

 　　數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)中，two-sample Kolmogorov-Smirnov(K-S test)檢驗(yàn)通常用于推斷兩樣本分別代表的兩總體分布是否相同.因此借助Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)分析本土與美國(guó)毒性數(shù)據(jù)二者之間是否存在顯著性差異具有十分重要的學(xué)術(shù)價(jià)值：①如果兩者有顯著性差異，那么驗(yàn)證了我們學(xué)術(shù)界有必要進(jìn)行選取本土水生生物進(jìn)行相關(guān)的基準(zhǔn)閾值研究;②如果兩者無(wú)顯著性差異，那么證明在本土基準(zhǔn)閾值推導(dǎo)過(guò)程中可以采用已經(jīng)報(bào)道過(guò)的美國(guó)水生生物毒性數(shù)據(jù)，從而減少重復(fù)的人力物力投入及受試生物的消耗.K-S結(jié)果如下：(Ks = 1.342, n1 = 10, n2 = 9, p = 0.08).p =0.08>0.05，按a=0.05水準(zhǔn)，認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)對(duì)PHE毒性敏感的總體分布基本相同，兩組數(shù)據(jù)之間不存在顯著性差異性(圖 1).

　　3.4 PHE水生生物水質(zhì)基準(zhǔn)閾值推導(dǎo)

　　本文采用USEPA“指南”推薦的SSR方法對(duì)基于實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)的PHE水生生物基準(zhǔn)閾值進(jìn)行了計(jì)算，本土物種SMAV值和GMAV值排序見(jiàn)表 5，計(jì)算得出我國(guó)PHE的急性基準(zhǔn)閾值CMC為0.033 mg·L-1，該值是由FAV(0.066 mg·L-1)除以評(píng)價(jià)因子(通常取值為2)所得.由于我國(guó)PHE慢性毒性數(shù)據(jù)稀少，本文采用“指南”推薦的FCV=FAV/FACR方法計(jì)算FCV值，F(xiàn)ACR(5.51)是通過(guò)3種水生生物SACR的幾何平均值算出(本研究中大型溞、錦鯉和泥鰍的SACR分別是4.18、5.86和6.82)，最終得出FCV值為0.012 mg·L-1，而FCV值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PHE植物毒性值(浮萍，0.658 mg·L-1)，因此能對(duì)植物起到保護(hù)作用.“指南”指出，CCC是由FCV、FPV和FRV中較小的值確定.由于我國(guó)相應(yīng)的MPC和BCF值缺乏，而且植物的敏感性通常遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于動(dòng)物，因此在很多情況下可以不計(jì)算FRV，直接用FCV值計(jì)算CCC.最終得出我國(guó)PHE的慢性基準(zhǔn)閾值CCC為0.012 mg·L-1.

 　　4 討論

　　前人研究報(bào)道大型溞的96 h LC50為0.230 mg·L-1，這與本研究的結(jié)果(0.275 mg·L-1)相似.前人通過(guò)物種敏感性比較得出麥穗魚對(duì)有機(jī)污染物特別是殺蟲劑的敏感性較高，Yan等通過(guò)毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)麥穗魚對(duì)溴代阻燃劑(TBBPA)的敏感性較高，因此，可以初步判斷本土水生生物中，魚類中的麥穗可能是一種對(duì)有機(jī)化合物相對(duì)敏感的物種.Edsall等研究發(fā)現(xiàn)虹鱒魚苗對(duì)有機(jī)氯農(nóng)藥(OCPs)較為敏感.另外，Wang等通過(guò)毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，泥鰍對(duì)廣譜抗菌劑三氯生(TCS)的敏感性較高，但本文的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)泥鰍對(duì)PHE的敏感性最低，這可能是由于不同化合物對(duì)水體底層的水生生物產(chǎn)生毒性影響不盡相同導(dǎo)致的(Paolo et al., 2004).

　　由于美國(guó)生物毒性數(shù)據(jù)不包括昆蟲和兩棲類水生生物，將本土昆蟲類搖蚊幼蟲、兩棲類動(dòng)物澤蛙蝌蚪的毒性數(shù)據(jù)去除之后再次進(jìn)行K-S檢驗(yàn)，p=0.13>0.05(Ks= 0.830, n1 = 8, n2= 7).因此，這表明PHE本土與美國(guó)生物的敏感性不存在顯著性差異，這表明直接使用美國(guó)水生生物毒性數(shù)據(jù)來(lái)推導(dǎo)我國(guó)本土水生生物基準(zhǔn)閾值是可行的，這與前人研究結(jié)果相符.

　　另外，借助荷蘭RIVM公布的ETX2.0軟件及環(huán)保部《淡水水生生物水質(zhì)基準(zhǔn)制定技術(shù)指南》推薦的敏感度分布(SSD)法求出HC5值，分別是0.102和0.0854 mg·L-1.因此當(dāng)評(píng)價(jià)因子確定為2時(shí)，這兩種SSD曲線計(jì)算得出的CMC分別為0.051和0.0427 mg·L-1，可以看出，與US EPA“指南”中推薦的SSR法求出的CMC(0.033 mg·L-1)相比較同在一個(gè)數(shù)量級(jí).

　　5 結(jié)論

　　1) 采用US EPA“指南”推薦的方法對(duì)菲本土水生生物急性基準(zhǔn)閾值(CMC)和慢性基準(zhǔn)閾值(CCC)進(jìn)行了推導(dǎo)，分別為0.033 mg·L-1和0.012 mg·L-1;另外，借助荷蘭RIVM公布的ETX2.0軟件及歐盟推薦的SSD方法進(jìn)行基準(zhǔn)閾值的驗(yàn)證，結(jié)果顯示兩種方法所得閾值與SSR法處在同一數(shù)量級(jí).具體聯(lián)系污水寶或參見(jiàn)http://szhmdq.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　2) 本土與美國(guó)物種之間敏感性不存在顯著性差異，這表明存在使用美國(guó)水生生物毒性數(shù)據(jù)來(lái)推導(dǎo)我國(guó)菲水生生物基準(zhǔn)閾值的可能性.