目前，厭氧氨氧化（ANAMMOX）工藝被廣泛應(yīng)用。在有機物存在的環(huán)境中，ANAMMOX和反硝化可以協(xié)同作用，從而減弱有機物對ANAMMOX的影響，提高脫氮性能。在耦合系統(tǒng)中，當(dāng)有機物濃度過高時，會使反硝化活性增強，ANAMMOX失去反應(yīng)的主導(dǎo)作用，從而破壞耦合系統(tǒng)的平衡，使整體脫氮性能下降。有研究表明，適當(dāng)提高亞硝態(tài)氮濃度，可有效緩解這種抑制作用。

亞硝態(tài)氮作為ANAMMOX和反硝化反應(yīng)的共同基質(zhì)，不足時會對脫氮性能產(chǎn)生影響，不利于很好地反映厭氧氨氧化反應(yīng)器對有機物的極限承受能力。研究表明，保證亞硝態(tài)氮充足，以葡萄糖為有機物，當(dāng)進(jìn)水葡萄糖濃度（以COD計）為100mg/L時，顆粒污泥具有良好的厭氧氨氧化耦合反硝化脫氮活性，而當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到200mg/L時，顆粒污泥的厭氧氨氧化耦合反硝化脫氮活性較差。由于不同種類不同濃度的有機物對厭氧氨氧化菌和反硝化菌的影響不同，因此有必要研究其他有機物在亞硝態(tài)氮充足的條件下對厭氧氨氧化耦合反硝化系統(tǒng)的影響。乙酸鈉為常見的有機物，相比葡萄糖，其代謝途徑較簡單、反硝化速率較快。為此，筆者利用連續(xù)流反應(yīng)器，在底物亞硝態(tài)氮充足的條件下，考察不同濃度乙酸鈉對厭氧氨氧化顆粒污泥反應(yīng)器脫氮性能的影響，并通過皮爾遜相關(guān)性分析探討反應(yīng)器中不同底物變化量的相關(guān)性，同時，采用高通量測序方法考察添加乙酸鈉前后顆粒污泥的菌群變化情況，進(jìn)一步明確不同有機物對耦合脫氮顆粒污泥反應(yīng)器的抑制特性，以期為相關(guān)研究和應(yīng)用提供借鑒。

1、材料和方法

1.1 實驗裝置

本實驗為連續(xù)流實驗，采用有效容積為10L的UASB厭氧氨氧化顆粒污泥反應(yīng)器，如圖1所示，外部包裹黑色軟性材料以避光。

進(jìn)水由蠕動泵打入反應(yīng)器底部，通過水浴控制反應(yīng)器內(nèi)溫度為25℃，水力停留時間（HRT）控制在0.96h，顆粒污泥上方填充直徑為2.5cm的鮑爾環(huán)載體以減少污泥流失。

1.2 接種污泥和進(jìn)水水質(zhì)

反應(yīng)器接種4L厭氧氨氧化顆粒污泥，其揮發(fā)性懸浮固體濃度為4500mg/L，平均粒徑為2mm。

反應(yīng)器進(jìn)水采用人工配水，主要成分為NH4Cl、NaNO2、NaHCO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、有機物（乙酸鈉）和微量元素。NaHCO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2濃度分別為1.25、0.01、0.3和0.0056g/L。實驗分為4個階段，各個階段的進(jìn)水NH4Cl、NaNO2、乙酸鈉（以COD計）濃度見表1。為了保證底物亞硝態(tài)氮充足，在不同階段相應(yīng)地提高進(jìn)水亞硝態(tài)氮濃度。

1.3 分析項目和方法

NH4+-N：納氏試劑分光光度法；NO2--N：N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法；NO3--N：麝香草酚分光光度法；MLSS、MLVSS：重量法；溫度：WTW/Multi3420測定儀。取NH4+-N、NO2--N和NO3--N濃度之和為TN濃度。

采用細(xì)菌16SrRNA高通量測序技術(shù)分析顆粒污泥的菌群結(jié)構(gòu)及變化。在不同運行階段從反應(yīng)器中取顆粒污泥樣品（取穩(wěn)定運行期即階段A的顆粒污泥樣品R1和以乙酸鈉為有機物時運行末期即階段D的顆粒污泥樣品R3），送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行高通量測序分析。將高通量測序結(jié)果得到的有效序列進(jìn)行聚類分析，采用Usearch軟件把相似度為97%的序列歸為同一個OTU。將得到的全部OTU與RDP數(shù)據(jù)庫比對，在門和屬進(jìn)行不同分類學(xué)水平的菌群結(jié)構(gòu)分析。

1.4 計算方法

對反應(yīng)器中的厭氧氨氧化耦合反硝化脫氮性能進(jìn)行分析，具體計算公式如下（下角標(biāo)AN和DN分別表示厭氧氨氧化和反硝化）

厭氧氨氧化對NO2--N的去除比例（η1）和反硝化對NO2--N的去除比例（η2）的計算方法如下：

本實驗以氮素的降解速率評價耦合系統(tǒng)的污泥活性及脫氮性能。

2、結(jié)果與討論

2.1 亞硝態(tài)氮足量時反應(yīng)器的脫氮性能

底物亞硝態(tài)氮足量時，乙酸鈉濃度對厭氧氨氧化反應(yīng)器脫氮性能的影響如圖2和圖3所示。階段A進(jìn)水中未添加乙酸鈉有機物，反應(yīng)器具有良好的厭氧氨氧化脫氮性能，出水NH4+-N、NO2--N和NO3--N濃度平均值分別為1.6、7.3和18.1mg/L，NH4+-N、NO2--N和TN的平均去除率分別為96.5%、89.5%和77.5%。階段B、C、D進(jìn)水中分別添加了20、35和50mg/L的乙酸鈉有機物，為了保證反應(yīng)器內(nèi)的底物亞硝態(tài)氮足量，進(jìn)水NO2--N濃度均提高至77mg/L左右，出水NO2--N濃度為8.8~56.7mg/L，出水TN濃度逐漸升高，到階段D末期（第120天），TN濃度升至104.4mg/L，TN去除率降為18.7%，耦合系統(tǒng)的脫氮性能受到嚴(yán)重影響。

由圖3可知，氨氮去除率在階段B的前12d（即第31~42天）保持穩(wěn)定并維持在較高水平（約為98.14%），較階段A有所提升。但從第43天開始，氨氮去除率開始降低，到階段D末期，氨氮去除率降到8.74%（第120天）。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，通過厭氧氨氧化去除的亞硝態(tài)氮比例顯著降低。經(jīng)過計算，在階段B，厭氧氨氧化過程消耗的NO2--N比例平均為89.47%，此時ANAMMOX占耦合反應(yīng)的主要地位，耦合效果良好；階段C結(jié)束時（第90天）為86%左右；在階段D，厭氧氨氧化消耗的NO2--N比例持續(xù)降低，第120天降到34.32%，ANAMMOX失去耦合反應(yīng)的主導(dǎo)地位，體系中主要為反硝化作用。

在本實驗中，以乙酸鈉為有機物，保證系統(tǒng)內(nèi)NO2--N充足，提高乙酸鈉濃度，短期內(nèi)對厭氧氨氧化細(xì)菌沒有影響（階段B前12d），但繼續(xù)馴化則導(dǎo)致氨氮去除率降低。當(dāng)乙酸鈉濃度為20mg/L時，系統(tǒng)的脫氮性能良好，但ANAMMOX活性受到部分影響；當(dāng)乙酸鈉濃度增至50mg/L時，ANAMMOX受到嚴(yán)重抑制，耦合系統(tǒng)的脫氮性能變差。而在以往的研究中，以葡萄糖為有機物、當(dāng)COD濃度為50mg/L時，系統(tǒng)的脫氮性能良好且ANAMMOX活性并未受到影響；當(dāng)COD濃度升高到200mg/L時，系統(tǒng)脫氮性能開始明顯降低，ANAMMOX活性出現(xiàn)明顯抑制。分析原因，這主要與葡萄糖和乙酸鈉的代謝不同有關(guān)，相比葡萄糖，乙酸鈉為小分子有機物，代謝較為簡單，對厭氧氨氧化細(xì)菌影響較大。Zheng等的研究表明，在相同C/N下，分別以葡萄糖和乙酸鈉為有機物時系統(tǒng)對氨氮的去除量分別為31.1、15.0mg/L，乙酸鈉對厭氧氨氧化的抑制更強烈；劉常敬等通過連續(xù)流和血清瓶批式實驗發(fā)現(xiàn)，從TN去除率來看，在苯甲酸鈉、鄰苯二酚、間苯二酚、丙酸鈉、乙酸鈉5種有機物中，乙酸鈉對耦合反應(yīng)器的影響最大，TN去除率最低；而張詩穎等在厭氧氨氧化與反硝化協(xié)同脫氮的研究中，提高有機物乙酸鈉濃度后，出水NH4+-N濃度大幅上升，厭氧氨氧化細(xì)菌活性大大降低。

2.2 微生物觀察和菌屬分析

2.2.1 各階段顆粒污泥形貌變化

圖4為各階段顆粒污泥的照片。階段A顆粒污泥呈鮮艷的磚紅色，從階段B至階段D，顆粒污泥黑色區(qū)域逐漸增加。顆粒污泥的粒徑也隨著有機物濃度的增加而逐漸減小，這與以葡萄糖為碳源時的結(jié)果相同。

2.2.2 微生物高通量測序結(jié)果分析

圖5（a）和（c）為R1和R3顆粒污泥在門水平上的菌群分布特性。在2個樣品中Proteobacteria均為優(yōu)勢菌群，添加有機物后R3中Proteobacteria的豐度高于R1。Proteobacteria門中包含大多數(shù)的反硝化細(xì)菌，系統(tǒng)中添加有機物后，反硝化菌比例增多。而在R3中Planctomycetes和Acidobacteria的占比與R1相比均有所降低，Planctomycetes門中包含了已知的厭氧氨氧化菌的所有屬，其比例降低也是添加有機物后反應(yīng)器中厭氧氨氧化活性降低的主要原因。另外，在2個樣品中Bacteroidetes的比例變化不大，且都含有Chloroflexi和Firmicutes門。以上6類門水平的微生物占比之和在2個樣品中均超過94%，因此，在本實驗中添加有機物后，顆粒污泥中的微生物種類在門水平上變化不大。

圖5（b）和（d）為R1和R3顆粒污泥在屬水平上的菌群分布特性�？芍�，R1和R3顆粒污泥的主要厭氧氨氧化菌屬都為CandidatusKuenenia，所占比例分別為20.42%和2.30%，表明在厭氧氨氧化反應(yīng)器中加入乙酸鈉后，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)馴化，并未改變厭氧氨氧化菌屬，原因可能是CandidatusKuenenia菌屬的基質(zhì)耐受力較高。但隨著有機物濃度的不斷提高，在階段D，CandidatusKuenenia菌屬所占比例均比初始的穩(wěn)定運行階段（階段A）有所降低。Liang等在厭氧氨氧化反應(yīng)器中添加乙酸鈉后，CandidatusKuenenia菌的數(shù)量下降明顯，與本實驗的結(jié)果相一致。

R1中具有反硝化特性的菌屬有Thauera（2.39%）、Thermomonas（0.59%）、Aquabacterium（1.74%）、Longilinea（2.05%）和Ignavibacterium（3.38%）等，相對豐度較低。與R1相比，R3新增了多種反硝化菌屬，且相對豐度較高。

根據(jù)細(xì)菌相對豐度的不同，可將富集的細(xì)菌分為三大類：①所占比例高于13%，稱為富集的優(yōu)勢菌；②所占比例為1%~13%，稱為富集的主要菌；③所占比例為0.2%~1%，稱為富集的稀有菌。由圖5可知，R1中優(yōu)勢菌屬為厭氧氨氧化菌屬，R3中優(yōu)勢菌屬為反硝化菌屬。隨著有機物的添加，顆粒污泥中反硝化菌所占比例不斷增加，豐度較高，厭氧氨氧化菌處于劣勢，嚴(yán)重影響了整體脫氮效果，這與系統(tǒng)氮素變化及顆粒污泥外觀變化相一致。

Du等通過高通量檢測DEAMOX系統(tǒng)中菌群結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)在門水平上Proteobacteria一直為優(yōu)勢菌門，在屬水平上Thauera在整個菌群中占較大優(yōu)勢，這與本研究的結(jié)果一致。但在他的研究中，檢測出的主要厭氧氨氧化菌屬為CandidatusBrocadia，而在本研究中，厭氧氨氧化耦合反硝化系統(tǒng)中的厭氧氨氧化菌屬為CandidatusKuenenia。分析原因，可能是由于反應(yīng)器運行方式及進(jìn)水水質(zhì)不同，使得厭氧氨氧化菌屬有所差異。

3、結(jié)論

①當(dāng)?shù)孜飦喯鯌B(tài)氮足量且進(jìn)水中有機物乙酸鈉濃度為20mg/L時，厭氧氨氧化顆粒污泥反應(yīng)器可實現(xiàn)良好的耦合脫氮性能，厭氧氨氧化活性受到部分影響。系統(tǒng)對NH4+-N的去除率和厭氧氨氧化對NO2--N的去除比例均先升高后降低，NH4+-N去除率為80.28%~98.14%，厭氧氨氧化對NO2--N的去除比例為76.70%~100%，平均為89.47%。

②當(dāng)?shù)孜飦喯鯌B(tài)氮足量且進(jìn)水中有機物乙酸鈉濃度為35~50mg/L時，厭氧氨氧化顆粒污泥反應(yīng)器的耦合脫氮性能明顯下降，厭氧氨氧化活性受到較強的抑制。當(dāng)乙酸鈉濃度為50mg/L、反應(yīng)器運行至第120天時，NH4+-N去除率降至8.74%，厭氧氨氧化過程的NO2--N去除比例為34.32%。

③穩(wěn)定運行期即階段A和以乙酸鈉為有機物時運行末期即階段D的顆粒污泥中主要厭氧氨氧化菌屬都為CandidatusKuenenia，所占比例分別為20.42%和2.30%。隨著有機物濃度的增加，顆粒污泥中厭氧氨氧化菌的生物密度逐漸降低，反硝化菌的生物密度逐漸增加，厭氧氨氧化菌處于劣勢。（來源：大連市市政設(shè)計研究院有限責(zé)任公司）