據(jù)統(tǒng)計，2021年，全球葡萄種植面積達到734×104hm2，葡萄酒產(chǎn)量超過2500×107L。葡萄酒生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的有機廢水主要來源于加工設(shè)備的清洗和殘液的排出，這些廢水中含有大量由醇、糖和有機酸組成的溶解性有機物、微量營養(yǎng)素、多酚類化合物。受葡萄生長周期的影響，在9-11月，葡萄酒釀制高峰期所產(chǎn)生的廢水量及廢水中的有機物濃度增加明顯。綜上，葡萄酒生產(chǎn)廢水總體呈酸性，色度和有機物濃度高，可生化性好，但水質(zhì)、水量季節(jié)性波動明顯。

厭氧消化作為一種能高效降解有機質(zhì)的技術(shù)，被廣泛用于葡萄酒生產(chǎn)廢水的預(yù)處理過程。厭氧序批式生物膜反應(yīng)器(AnSBBR)兼?zhèn)渖�物膜法、序批式反�?yīng)器的優(yōu)點。生物膜法通過載體富集微生物，從而增加了反應(yīng)器中生物質(zhì)的濃度和多樣性，提高了系統(tǒng)的抗沖擊能力。序批式工藝不僅自動化程度高，還存在周期性循環(huán)和完全混合的特性，從而提高了抗沖擊能力。目前，AnSBBR優(yōu)異的處理性能和抗沖擊能力已在生物柴油、甘油和金屬加工等多種廢水的處理研究中得以證實，但其對葡萄酒生產(chǎn)廢水的處理負荷和消化性能尚不明確。

通常，較低的有機負荷(OLR)雖利于反應(yīng)器的運行穩(wěn)定，但增加了運行成本；而高OLR雖有助于有機物利用，但易導(dǎo)致系統(tǒng)酸化。故通過逐步提高OLR探索AnSBBR處理葡萄酒生產(chǎn)廢水所能承受的最大OLR尤為重要。目前，厭氧反應(yīng)器在不同OLR下處理葡萄酒生產(chǎn)廢水的研究主要是OLR對消化性能的影響。然而，微生物對環(huán)境變化敏感，高OLR下導(dǎo)致反應(yīng)器運行失敗的原因是破壞了體系中菌群結(jié)構(gòu)的平衡。因此，有必要深入探究OLR變化對菌群結(jié)構(gòu)的影響。

本研究采用AnSBBR處理模擬葡萄酒生產(chǎn)廢水，通過監(jiān)測AnSBBR各OLR運行期間出水水質(zhì)、甲烷產(chǎn)量和產(chǎn)甲烷活性等來評估AnSBBR處理葡萄酒生產(chǎn)廢水的性能，利用高通量測序?qū)ι�物膜體系中群落結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律進行解析，確定AnSBBR處理葡萄酒生產(chǎn)廢水的最佳工況條件，旨在為推動AnSBBR的工程化應(yīng)用提供依據(jù)。

1、材料與方法

1.1 接種污泥和進水

實驗所用生物膜填料和活性污泥取自西安市第四污水廠缺氧池，生物膜載體為K3填料(直徑25mm，比表面積500m2·m−3)，填料上掛膜量為2507.6mg·m−2，反應(yīng)器中生物填充率為35%。使用4L活性污泥(5677.5mg·L−1)用于掛膜。進水用實際葡萄酒水稀釋配制，葡萄酒COD為(220450±2100)mg·L−1，總磷為(26.1±1.3)mg·L−1，總氮為(1479±37)mg·L−1，乙酸為(1409.6±13.8)mg·L−1，多糖為(2524.84±65.37)mg·L−1，蛋白質(zhì)為(17899.47±203.31)mg·L−1，pH為3.99±0.2，投加碳酸氫鈉控制進水pH為7.3~7.5。

1.2 實驗裝置與運行

實驗所用AnSBBR有效容積為10L，φ270mm×360mm。采用蠕動泵間歇進水、推流泵攪拌，控制溫度為(35±1)℃，進出水和攪拌采用可編程控制器(PLC)控制，產(chǎn)生的沼氣流入濕式氣體流量計。

AnSBBR運行過程分為馴化啟動、強化和穩(wěn)定3個階段，實驗期間進水COD、水力停留時間和有機負荷見表1。反應(yīng)器采取低負荷啟動，起始COD為(1±0.1)g·L−1，通過縮短HRT提高有機負荷以完成對生物膜的馴化培養(yǎng)，處理后的廢水用于灌溉時，需滿足農(nóng)田灌溉標準(GB5084-2021)中旱作物對COD排放的要求(COD<200mg·L−1)。強化階段，根據(jù)BEZERRA等的方法提升OLR。強化和穩(wěn)定階段的運行周期為4h(包括進水5min、反應(yīng)230min、出水5min)，進水體積為2L。

1.3 產(chǎn)甲烷速率測試

產(chǎn)甲烷速率測試能夠評估厭氧污泥的產(chǎn)甲烷潛力，分別在3種負荷(1.2、5.4、9.6g·(L·d)−1))下和接種污泥中進行。生物膜填料用PBS清洗3次后，加入250mL厭氧瓶中，再加入150mL營養(yǎng)液。氮吹5min以排出瓶中空氣，將厭氧瓶置于35℃水浴搖床，用排水集氣法測定甲烷，并配制2mol·L−1NaOH溶液，吸收H2S和CO2。最后利用Gompertz模型方程對產(chǎn)甲烷過程進行擬合分析，模型方程見式(1)。

式中：Pt為t時刻累積甲烷產(chǎn)量，mL·g−1(以TS計)；Pmax為最大甲烷產(chǎn)量，mL·g−1(以TS計)；Rmax為最大甲烷產(chǎn)率，mL·(g·h)−1(以TS計)；e=2.7183；λ為停滯時間，h。

1.4 分析項目及方法

1)理化指標分析。

采用哈希(DRB-200)消解儀消解COD；采用雷磁PHS-3C測定pH；采用濕式氣體流量計(LMF-1)計量沼氣；采用標準方法分析TS、VS；聯(lián)合滴定法測定總堿度(TA)、部分堿度(PA)，pH滴定終點分別3.8和5.75，碳酸氫鹽堿度(BA)為1.2PA；采用FID-氣相色譜儀(SP-3420A)測定VFAs；采用TCD-氣相色譜儀(SP-3420A)測定沼氣組分；參照LI等的熱提法提取胞外聚合物(EPS)并分別用苯酚硫酸法和福林酚法測定多糖(PS)和蛋白質(zhì)(PN)；參照趙陽等的方法測定輔酶F420濃度；參照ZHAO等的方法測定INT-ETS；參照李韌等的方法測定生物膜量。

2)高通量測序。

取接種和反應(yīng)器3種負荷(OLR為1.2、5.4和9.6g·(L·d)−1)的生物膜污泥，運用高通量測序技術(shù)對微生物群落結(jié)構(gòu)進行分析。細菌和古菌用帶有barcode特異性引物515FmodF(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806RmodR(5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′)，針對全菌16SrRNA基因進行PCR擴增并利用Illumina公司的MiseqPE300平臺進行測序。使用IBMSPSS25.0軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，采用t檢驗，顯著性水平為P<0.05差異顯著。

2、結(jié)果與分析

2.1 AnSBBR運行效果分析

1)AnSBBR的運行特性。反應(yīng)器連續(xù)運行的效果見圖1。反應(yīng)器經(jīng)37d馴化培養(yǎng)后，COD去除率由(52.2±17.4)%增至(75±12.2)%，出水COD降至(171±30)mg·L−1，滿足了農(nóng)田灌溉標準(GB5084-2021)中旱作物對COD值的要求，表示AnSBBR啟動成功。強化運行階段(OLR為1.2~9.6g·(L·d)−1)，COD去除率(圖1(a))由81.6%增至97.7%，沼氣產(chǎn)量(圖1(b))由0.37L·(L·d)−1增至4.6L·(L·d)−1。pH在6.8~7.8內(nèi)，TVFA為66~193mg·L−1，總堿度為780~1520mg·L−1；穩(wěn)定運行階段(OLR為9.6~10.2g·(L·d)−1)，當(dāng)OLR為10.2g·(L·d)−1時，出水COD最大，達到675mg·L−1，COD去除率降至94.9%，甲烷產(chǎn)率降至(332.4±28.7)mL·g−1，TVFA為532mg·L−1。隨后OLR降至9.6g·(L·d)−1，運行16d后，反應(yīng)器各項運行參數(shù)重新恢復(fù)正常�？梢钥闯�，AnSBBR處理OLR為1.2~9.6g·(L·d)−1的葡萄酒生產(chǎn)廢水時，具備優(yōu)異的處理性能。

圖1 連續(xù)運行下AnSBBR的性能表現(xiàn)

2)OLR對AnSBBR性能及穩(wěn)定性的影響。有機物降解及甲烷產(chǎn)量是評價厭氧反應(yīng)器消化效率的重要指標。OLR對反應(yīng)器性能及穩(wěn)定性的影響見圖2。OLR超過2.4g·(L·d)−1后，COD去除率維持在較高的水平(>96%)(圖2(a))。當(dāng)OLR為1.2~5.4g·(L·d)−1時，甲烷產(chǎn)率隨OLR的提升而增加，OLR超過5.4g·(L·d)−1后甲烷產(chǎn)率隨OLR的提升而減少。當(dāng)OLR為5.4g·(L·d)−1時，甲烷產(chǎn)率最大，達到(349.9±7.6)mL·g−1。對比穩(wěn)定階段前后結(jié)果，可以看出，重新恢復(fù)后的反應(yīng)器在COD去除率和甲烷產(chǎn)率方面表現(xiàn)更好。此外，與其他厭氧反應(yīng)器對比，可以看出，AnSBBR在出水COD和甲烷產(chǎn)率方面更具優(yōu)勢(表2)。

圖2 OLR對AnSBBR的性能及穩(wěn)定性的影響

系統(tǒng)的緩沖能力是評估反應(yīng)器運行穩(wěn)定性的關(guān)鍵指標，其變化受消化過程中堿度和VFAs的共同影響。當(dāng)OLR為10.2g·(L·d)−1時，pH降至7.0以下，但總堿度波動較小(圖1(c))，TVFA/TA<0.4(圖2(b))。這是因為碳酸氫鹽堿度被消耗轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸堿度，但后者不能提供緩沖，從而出現(xiàn)pH降低但總堿度變化小的情況。這說明，TVFA/TA無法準確表示體系緩沖能力的變化情況，故再引入TVFA/BA。通常，在高OLR下，TVFA/BA<0.4時，系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)OLR為1.2~9.6g·(L·d)−1)時，比值低于0.4，反應(yīng)器緩沖能力良好(圖2(b))；當(dāng)OLR為10.2g·(L·d)−1)時，比值增至(0.81±0.13)，反應(yīng)器酸化風(fēng)險激增。此時，乙酸增至(366.18±27.79)mg·L−1，丙酸為(51.63±10.35)mg·L−1，丁酸為(30.44±6.52)mg·L−1(圖2(d))，且體系中VFAs呈現(xiàn)出繼續(xù)增加的趨勢，表明反應(yīng)器無法適應(yīng)OLR為10.2g·(L·d)−1的運行條件。

2.2 生物膜體系特性

1)生物膜量。微生物利用有機物代謝并在填料表面聚集形成生物膜，并通過脫落更新來穩(wěn)定生物量。OLR對生物量的影響見圖3。與接種污泥相比，當(dāng)OLR為1.2g·(L·d)−1)時，生物量為1802.8mg·m−2，減少了28.0%(圖3(a))，這是部分原有微生物無法適應(yīng)新環(huán)境導(dǎo)致的死亡脫落。在OLR從1.2g·(L·d)−1增至9.6g·(L·d)−1后，生物膜量由1802.8mg·m−2增至7108.8mg·m−2。這不僅得益于廢水中有機物易被微生物代謝利用，還因序批式工藝存在“吸收-儲存-利用”的特性，促進了微生物的增殖。

圖3 OLR對掛膜生物量，輔酶F420和INT-ETS活性的影響

輔酶F420是產(chǎn)甲烷菌特有的一種低電位電子載體。REYNOLDS等認為，輔酶F420由氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌分泌，其濃度可反映產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量或產(chǎn)甲烷活性。INT-ETS活性指微生物的電子傳遞速率，反映厭氧微生物的活性。輔酶F420濃度和INT-ETS活性隨負荷的提升而增加(圖3(b))，在OLR從1.2g·(L·d)−1增至5.4g·(L·d)−1期間，輔酶F420濃度和INT-ETS活性增加最為明顯，分別增加了115.2%和102.9%。

圖4反映了OLR對產(chǎn)甲烷速率的影響。使用Gompertz模型對結(jié)果進行擬合，結(jié)果見表3。針對特定的廢水，接種污泥對其降解的能力不足，甲烷產(chǎn)量和產(chǎn)甲烷速率分別為19.16mL·g−1和2.83mL·(g·h)−1。馴化后甲烷產(chǎn)量顯著增加，達到67.95mL·g−1，產(chǎn)甲烷速率為34.44mL·(g·h)−1。當(dāng)OLR為9.6g·(L·d)−1時，產(chǎn)甲烷速率最大，為59.36mL·(g·h)−1，累計甲烷產(chǎn)量達到了172.68mL·g−1。可以看出，生物膜的產(chǎn)甲烷速率隨OLR的提升而提高，在OLR從1.2g·(L·d)−1增至5.4g·(L·d)−1期間，產(chǎn)甲烷速率提高較明顯，產(chǎn)甲烷速率和甲烷產(chǎn)量分別提高了68.0%和125.8%。

圖4 OLR對產(chǎn)甲烷速率的影響

總體來看，生物膜量、輔酶F420濃度、INT-ETS活性和產(chǎn)甲烷速率隨OLR的提升呈現(xiàn)不同程度的增加，但是在較高OLR下，增加速率明顯減緩。這說明，逐級提升OLR的運行策略可促進相關(guān)功能菌的富集，并加快微生物對基質(zhì)的利用速率。但由于產(chǎn)甲烷菌屬對OLR的適應(yīng)范圍存在差異，過高的OLR對部分產(chǎn)甲烷菌生長和代謝產(chǎn)生抑制，導(dǎo)致后續(xù)OLR提升過程對生物膜體系的促進效果削弱。

2)EPS特性。生物膜體系中胞外聚合物是實現(xiàn)微生物與載體、微生物與微生物之間黏附的關(guān)鍵，通過細胞分泌、脫落和外部吸附等途徑形成，主要由蛋白質(zhì)和多糖組成。EPS空間結(jié)構(gòu)包括溶解態(tài)EPS(Slime-EPS)、松散型EPS(LB-EPS)和緊密型EPS(TB-EPS)。馴化成功后的Slime-EPS和TB-EPS濃度相較于接種污泥明顯增加，Slime-PN和Slime-PS濃度分別提高了291.0%和103.0%，TB-PN和TB-PS濃度分別提高了58.5%和75.1%(圖5)。當(dāng)原有微生物因無法適應(yīng)新環(huán)境死亡脫落后被吸附在生物膜表面，從而使EPS最外層的Slime-EPS濃度明顯增加。TB-EPS是與細胞緊密結(jié)合的聚合物，當(dāng)反應(yīng)器成功啟動時，TB-EPS濃度的增加，有利于微生物聚集體的黏附聚集以及維持聚集體空間結(jié)構(gòu)和功能的完整。隨后，微生物代謝增殖消耗EPS表面吸附的過量營養(yǎng)物質(zhì)使得OLR為5.4g·(L·d)−1時EPS濃度降低。

圖5 OLR對EPS質(zhì)量分數(shù)及其蛋白質(zhì)和多糖濃度的影響

EPS存在于污泥表面，當(dāng)環(huán)境發(fā)生改變時，其組成成分更易受到影響。各層EPS中PN/PS比值隨負荷的提升而增加，當(dāng)OLR為9.6g·(L·d)−1時，Slime-PN/PS、LB-PN/PS和TB-PN/PS比值分別達到了3.54、2.56和3.28。PN具有疏水性，在逐級提升負荷期間，較高的PN/PS比值可以有效保證污泥的穩(wěn)定性。重新穩(wěn)定后，各層EPS中PN/PS的比值變小，分別為1.69、1.79和3.13。PN和PS攜帶相反的電荷基團，經(jīng)更高負荷沖擊后，為避免過高VFA濃度可能導(dǎo)致的生物膜解體，EPS組分中PN/PS比值變小可以有效減少聚集體間的靜電排斥力，從而使生物膜更加密實，以應(yīng)對高負荷環(huán)境對生物膜體系的影響。

2.3厭氧生物膜群落特性

1)門水平群落特性。門水平上菌群分布結(jié)果如圖6所示。經(jīng)馴化后，優(yōu)勢菌(相對豐度>7%)從Desulfobacterota(21.1%)、Proteobacteria(17.1%)、Chloroflexi(13.7%)、Bacteroidota(11.8%)和Firmicutes(10.3%)演替為Bacteroidota(22.4%)、Chloroflexi(19.5%)、Halobacterota(11.8%)、Euryarchaeota(11.7%)和Proteobacteria(7.4%)，這表明進水基質(zhì)組分將顯著影響微生物群落結(jié)構(gòu)。在OLR從1.2g·(L·d)−1增至9.6g·(L·d)−1期間，優(yōu)勢菌Proteobacteria(P>0.05)、Desulfobacterota(P<0.05)和Spirochaetota(P<0.05)豐度隨OLR提升而增加。Halobacterota(P<0.05)和Chloroflexi(P>0.05)豐度隨OLR提升而減少。Proteobacteria、Chloroflexi、Spirochaetota和Bacteroidota是中溫厭氧體系中常見的水解細菌，可將蛋白質(zhì)和碳水化合物降解為VFAs或乙醇等物質(zhì)。Firmicutes和Euryarchaeota豐度呈現(xiàn)先增后減的趨勢，而Bacteroidota豐度則是先減后增。這說明，在低OLR下，Firmicutes更易表現(xiàn)出高聚集性；在高OLR下，Bacteroidota生物活性更高。在釀造工序中會添加SO2抑制細菌，SO2氧化后以硫酸鹽的形式存在于廢水中，Desulfobacterota可將硫酸鹽轉(zhuǎn)化為硫化氫。

圖6 生物膜群落門水平上的相對豐度(豐度>2%)

Halobacterota和Euryarchaeota均為產(chǎn)甲烷古菌門。當(dāng)OLR為1.2、5.4和9.6g·(L·d)−1時，菌群中古菌門整體相對豐度分別約為22.5%、26.7%和16.5%。這表明，在OLR從1.2g·(L·d)−1增至5.4g·(L·d)−1期間，產(chǎn)甲烷古菌得到了富集，增強了AnSBBR的消化性能和穩(wěn)定性。在負荷進一步提升后，豐度明顯下降，說明高負荷環(huán)境對部分產(chǎn)甲烷古菌存在抑制效果。

2)屬水平群落特性。接種污泥經(jīng)馴化后，Methanobacterium(11.7%)、Methanosarcina(10.3%)、Anaerolineaceae_UCG-001(5.9%)、Longilinea(5.5%)和Leptolinea(4.3%)成為主要的菌屬(圖7)。Methanobacterium是利用H2/CO2產(chǎn)生CH4的嗜氫產(chǎn)甲烷菌，Methanosarcina是可同時利用乙酸、H2/CO2和甲基三種底物的產(chǎn)甲烷菌。因二者均屬r策略菌，具備世代時間短、比生長速率高的特性，在馴化后豐度明顯增加。Anaerolineaceae_UCG-001、Longilinea和Leptolinea可轉(zhuǎn)化多糖等碳水化合物為乙酸，葡萄酒生產(chǎn)廢水中豐富的有機物促進了菌屬的增殖。

圖7 生物膜群落屬水平上的相對豐度(豐度>1%)

在OLR從1.2g·(L·d)−1增至9.6g·(L·d)−1期間，主要存在4種古菌屬和8種細菌屬(相對豐度>3%)。Methanosarcina、Anaerolineaceae_UCG-001和Longilinea豐度隨OLR提升而減少(P>0.05)；Methanobrevibacter與Paludibacter(P>0.05)，Desulfovibrio與Treponema(P<0.05)豐度隨OLR提升而增加；Methanobacterium、Acinetobacter和Brevinema豐度呈現(xiàn)先增后減的趨勢，Methanosaeta豐度變化與之相反。

在OLR從1.2g·(L·d)−1增至5.4g·(L·d)−1后，Methanobacterium豐度由11.7%增至17.1%，Methanosaeta豐度由1.4%增至5.3%，Desulfovibrio豐度由0.8%增至5.6%，Brevinema豐度由0.01%增至4.6%，Methanosarcina豐度由10.3%降至3.7%，Anaerolineaceae_UCG-001豐度由5.9%降至1.7%，Longilinea豐度由5.5%降至1.3%。研究顯示，專性嗜乙酸產(chǎn)甲烷菌Methanosaeta在較低的OLR下對乙酸的利用率更高，從而抑制了Methanosarcina的生長。Desulfovibrio是典型的乙醇氧化菌，能夠代謝包括乙醇在內(nèi)的多種碳水化合物，隨進水有機物濃度的增加而逐漸富集。

在OLR從5.4g·(L·d)−1增至9.6g·(L·d)−1后，Desulfovibrio豐度由5.6%增至12.4%，Paludibacter豐度由1.3%增至5.8%，Methanobrevibacter豐度由0.02%增至3.3%，Treponema豐度從1.3%增至4.3%，Methanobacterium豐度由17.1%降至8.3%，Methanosaeta豐度由5.3%降至1.8%。Desulfovibrio進一步富集后，與Methanosaeta和Methanosarcina競爭基質(zhì)中的乙酸，又因Methanosarcina可利用多種基質(zhì)代謝，故受到的影響明顯小于Methanosaeta。Paludibacter為產(chǎn)酸菌，可利用多種單糖和二糖產(chǎn)生乙酸、丙酸，Treponema參與同型產(chǎn)乙酸過程。Methanobrevibacter可通過產(chǎn)生氧化型NAD+載體來提高產(chǎn)甲烷活性，并且在高OLR下生物活性更高。

當(dāng)OLR為1.2、5.4和9.6g·(L·d)−1時，菌群中整體古菌屬相對豐度分別約為23.4%、26.3%和16.2%；當(dāng)OLR為5.4g·(L·d)−1時，產(chǎn)甲烷古菌整體豐度最大并且存在Methanosphaerula(0.2%)等其他產(chǎn)甲烷菌。產(chǎn)甲烷過程作為厭氧消化的限速步驟，產(chǎn)甲烷菌的豐度越大、種類越多，越有利于提高生物膜體系的消化性能和應(yīng)對潛在環(huán)境變化的能力。

3、結(jié)論

1)在滿足出水COD低于200mg·L−1的前提下，AnSBBR可有效處理OLR為1.2~9.6g·(L·d)−1的葡萄酒生產(chǎn)廢水。OLR為5.4g·(L·d)−1時，運行性能最佳，COD去除率為(97.2±0.5)%，甲烷產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)率分別為20.2L·d−1和(349.9±7.6)mL·g−1。

2)與OLR為1.2g·(L·d)−1相比，OLR為9.6g·(L·d)−1時，產(chǎn)甲烷速率提高69.3%，生物膜量增加294.3%，輔酶F420濃度增加190.8%以及INT-ETS活性提高88.4%。這說明，逐級提升OLR的運行策略可促進厭氧生物膜體系的生長。

3)高通量測序顯示，群落中主要細菌為Desulfovibrio、Brevinema、Treponema、Longilinea、Paludibacter和Leptolinea，主要古菌為Methanobacterium、Methanobrevibacter，Methanosaeta和Methanosarcina，其相對豐度隨負荷的提升發(fā)生變化。當(dāng)OLR為5.4g·(L·d)−1時，產(chǎn)甲烷菌整體豐度最大且多樣性更高；當(dāng)OLR為9.6g·(L·d)−1時，培養(yǎng)出特定的菌屬(Methanobrevibacter)來適應(yīng)環(huán)境。（來源：寧夏大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，寧夏大學(xué)地理科學(xué)與規(guī)劃學(xué)院）