公布日：2023.09.22
申請(qǐng)日：2023.04.17
分類號(hào)：C12N1/21(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I;C12N15/53(2006.01)I;C12N15/55(2006.01)I;C12N1/36(2006.01)I;C02F3/34(2023.01)I;C12R1/19(2006.01)N;C02F101
/16(2006.01)N
摘要
本發(fā)明涉及污水處理與基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于高氨氮廢水的基因工程菌及其構(gòu)建方法。本發(fā)明基因工程菌保藏號(hào)為CCTCCNO：M2023301，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。在基因工程菌中加載氨單加氧酶基因與脂肪酶基因，氨單加氧酶是硝化菌代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，主要催化氨氮氧化形成羥胺，脂肪酶是一種特殊的酯鍵水解酶，能分解生物所產(chǎn)生的各種天然的油和脂肪，可降解污水中COD，氨單加氧酶基因協(xié)同脂肪酶基因，表達(dá)出氨單加氧酶與脂肪酶，實(shí)現(xiàn)高氨氮廢水中氨氮以及COD的去除。本發(fā)明基因工程菌在高氨氮廢水處理中COD去除率為94.02％～96.35％，氨氮去除率為93.62％～94.32％，脫氮、降解效果良好，同時(shí)廢水處理成本低、效率高、效果穩(wěn)定、無(wú)污染，便于在高氨氮廢水處理中應(yīng)用。
權(quán)利要求書(shū)
1.一種用于高氨氮廢水的基因工程菌，其特征在于：所述的基因工程菌具有如SEQIDNo.5所示的外源氨基酸序列，保藏號(hào)為CCTCCNO：M2023301，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于高氨氮廢水的基因工程菌，其特征在于：所述的基因工程菌中如SEQIDNo.5所示的氨基酸序列由如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列(氨單加氧酶基因)和如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列(脂肪酶基因)基因融合獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于高氨氮廢水的基因工程菌，其特征在于：所述的基因工程菌中表達(dá)如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列(氨單加氧酶基因)的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，表達(dá)如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列(脂肪酶基因)的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于高氨氮廢水的基因工程菌，其特征在于：所述的高氨氮廢水包括生活污水、工業(yè)廢水以及垃圾滲濾液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：1)獲得AMO(氨單加氧酶基因)-TLL5(脂肪酶基因)目的基因；2)將目的基因AMO-TLL5導(dǎo)入表達(dá)載體PET28a中獲得重組表達(dá)載體PET28a-AMO-TLL5；3)將重組表達(dá)載體PET28a-AMO-TLL5轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，挑陽(yáng)性克隆到LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)得到重組工程菌株BL21-PET28a-AMO-TLL5；4)將重組工程菌株BL21-PET28a-AMO-TLL5，在高濃度氨氮條件下馴化，得到具有處理高氨氮廢水能力的基因工程好氧硝化細(xì)菌；5)將該菌株投入到發(fā)酵培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，而后投入污水中使用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：所述的步驟1)中采用重疊PCR技術(shù)將AMO和TLL5融合表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：所述的步驟3)中LB培養(yǎng)基中抗生素的添加量為1‰，在37℃、200rpm搖床上培養(yǎng)10～12h。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：所述的步驟4)中高氨氮廢水中氨氮的濃度為400～600mg/L，COD濃度為600～650mg/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：所述的步驟5)中高氨氮廢水中COD的去除率為94.02％～96.35％，氨氮的去除率為93.62％～94.32％。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：所述的步驟5)中發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：每1L水中，硫酸銨1g，氯化鈉0.3g，七水硫酸亞鐵0.03g，七水硫酸鎂0.03g，三水磷酸氫二鉀1.3g，碳酸鈣5g，酵母提取物0.5g，蛋白胨1g。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于高氨氮廢水的基因工程菌及其構(gòu)建方法，以解決天然的硝化細(xì)菌培養(yǎng)困難、在高氨氮廢水處理過(guò)程中硝化反應(yīng)速率低以及脫氮效果不穩(wěn)定的問(wèn)題。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種用于高氨氮廢水的基因工程菌，所述的基因工程菌具有如SEQIDNo.5所示的外源氨基酸序列，保藏號(hào)為CCTCCNO：M2023301，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
進(jìn)一步地，所述的基因工程菌中如SEQIDNo.5所示的氨基酸序列由如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列(氨單加氧酶基因)和如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列(脂肪酶基因)基因融合獲得。
進(jìn)一步地，所述的基因工程菌中表達(dá)如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列(氨單加氧酶基因)的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，表達(dá)如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列(脂肪酶基因)的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。
進(jìn)一步地，所述的高氨氮廢水包括生活污水、工業(yè)廢水以及垃圾滲濾液。
上述基因工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
1)獲得AMO(氨單加氧酶基因)-TLL5(脂肪酶基因)目的基因；
2)將目的基因AMO-TLL5導(dǎo)入表達(dá)載體PET28a中獲得重組表達(dá)載體PET28a-AMO-TLL5；
3)將重組表達(dá)載體PET28a-AMO-TLL5轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，挑陽(yáng)性克隆到LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)得到重組工程菌株BL21-PET28a-AMO-TLL5；
4)將重組工程菌株BL21-PET28a-AMO-TLL5，在高濃度氨氮條件下馴化，得到具有處理高氨氮廢水能力的基因工程好氧硝化細(xì)菌；
5)將該菌株投入到發(fā)酵培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，而后投入污水中使用。
進(jìn)一步地，所述的步驟1)中采用重疊PCR技術(shù)將AMO和TLL5融合表達(dá)。
進(jìn)一步地，所述的步驟3)中LB培養(yǎng)基中抗生素的添加量為1‰，在37℃、200rpm搖床上培養(yǎng)10～12h。
進(jìn)一步地，所述的步驟4)中高濃度氨氮污水中氨氮的濃度為400～600mg/L，COD濃度為600～650mg/L。
進(jìn)一步地，所述的步驟5)中高氨氮廢水中COD的去除率為94.02％～96.35％，氨氮的去除率為93.62％～94.32％。
進(jìn)一步地，所述的步驟5)中發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：每1L水中，硫酸銨1g，氯化鈉0.3g，七水硫酸亞鐵0.03g，七水硫酸鎂0.03g，三水磷酸氫二鉀1.3g，碳酸鈣5g，酵母提取物0.5g，蛋白胨1g。
本發(fā)明的有益效果：基因工程菌在高氨氮廢水處理中COD去除率為94.02％～96.35％，氨氮去除率為93.62％～94.32％，脫氮、降解效果良好，同時(shí)廢水處理成本低、效率高、效果穩(wěn)定、無(wú)污染，便于在高氨氮廢水處理中應(yīng)用。
（發(fā)明人：杜莉莉;藺洪永;包海花;張涵儀;謝佳）
