氮素污染是我國水環(huán)境的主要污染之一，全程自養(yǎng)脫氮（CANON）工藝的出現(xiàn)為污水生物脫氮提供了新思路。該工藝在微氧條件下運行，一方面好氧氨氧化菌（AOB）將氨氮氧化成亞硝態(tài)氮，同時，厭氧氨氧化菌（AnAOB）將剩余的氨氮和生成的亞硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氮氣。與傳統(tǒng)的硝化反硝化工藝相比，CANON工藝具有節(jié)省有機(jī)碳源、減少污泥產(chǎn)量、降低耗氧量和耗堿量、無二次污染等優(yōu)點。然而，AnAOB生長速度緩慢，容易受到溫度、進(jìn)水基質(zhì)、pH等的影響。實際廢水中含有的重金屬、難降解有機(jī)化合物、病原菌等物質(zhì)也可能會影響AnAOB活性。
目前，全球已有200多座自養(yǎng)脫氮工藝設(shè)施投入使用，當(dāng)處理的污（廢）水中含有有毒物質(zhì)時，或者遭遇工廠周期性運行、設(shè)備維修、自然災(zāi)害以及不可抵擋的外來阻力而導(dǎo)致的長期停產(chǎn)時，污泥的理化性質(zhì)以及微生物活性會受到嚴(yán)重的影響，如何快速恢復(fù)CANON工藝的脫氮性能是其大規(guī)模應(yīng)用所必須要解決的問題。
CANON工藝在處理高氨氮廢水方面展現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力。然而，實際廢水成分復(fù)雜，含有多種有毒物質(zhì)，尤其是重金屬離子在各種廢水中被頻繁檢出，例如，在污水處理廠檢測到2.0μg/L的總汞，在工業(yè)廢水中檢測到30mg/L的Hg（Ⅱ）。Hg（Ⅱ）對微生物有強(qiáng)烈的毒害作用，抗汞細(xì)菌也只能耐受10mg/L的Hg（Ⅱ）。已有研究表明，Hg（Ⅱ）濃度達(dá)到20mg/L時，可使厭氧氨氧化系統(tǒng)的總氮去除率下降至55%，相關(guān)基因最大可改變468.8倍。然而，關(guān)于Hg（Ⅱ）是否對CANON系統(tǒng)存在持久性的影響，尤其是對其恢復(fù)能力的潛在影響目前尚未可知。而這對于污水廠接種CANON種泥的選擇、長期斷流后工藝恢復(fù)措施的設(shè)置等至關(guān)重要。
筆者以突發(fā)狀況下被迫停產(chǎn)的2個自養(yǎng)脫氮工藝運行的膜生物反應(yīng)器（MBR）為研究對象，探究了長期斷流后CANON工藝的恢復(fù)特性，主要包括脫氮性能、運行特征以及微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，考察了Hg（Ⅱ）長期暴露對斷流后CANON工藝恢復(fù)特性的影響，以期為實際工程中CANON工藝的恢復(fù)提供參考。
1、材料與方法
1.1 實驗裝置與方法
實驗裝置如圖1所示，采用2個完全相同的MBR，分別標(biāo)記為R1與R2。反應(yīng)器由雙層有機(jī)玻璃制成，高為70cm，內(nèi)徑為10cm，有效體積為4.5L，內(nèi)置中空纖維膜，膜絲有效面積為0.1m2，膜孔徑為0.1μm，底部安裝曝氣環(huán)進(jìn)行曝氣。在反應(yīng)器上部安裝轉(zhuǎn)子流量計和壓力表，分別用來控制溶解氧（DO）濃度和監(jiān)測膜污染程度，當(dāng)壓力表示數(shù)達(dá)到-30kPa時清洗膜組件。進(jìn)水和出水由蠕動泵控制，反應(yīng)器內(nèi)溫度為（25±3）℃。
在長期斷流階段，R1和R2反應(yīng)器在室內(nèi)放置了5個月，溫度為（10±5）℃。其中，R2在長期斷流前曾經(jīng)在Hg（Ⅱ）下長期暴露。長期斷流后，通過調(diào)整2個反應(yīng)器的運行參數(shù)進(jìn)行CANON工藝的恢復(fù)，具體運行條件如表1所示。
1.2 實驗用水
實驗用水為人工配制的模擬廢水，具體成分包括200mg/L的NH4+-N、1600mg/L的堿度（由NaHCO3提供）、68mg/L的CaCl2、68mg/L的KH2PO4、150mg/L的MgSO4、1mL/L的微量元素溶液Ⅰ和Ⅱ。其中，微量元素溶液Ⅰ的組分為：5000mg/L的EDTA、5000mg/L的FeSO4，微量元素溶液Ⅱ的組分為：15000mg/L的EDTA、430mg/L的ZnSO4·7H2O、240mg/L的CoCl2·6H2O、990mg/L的MnCl2·4H2O、250mg/L的CuSO4·5H2O、220mg/L的Na2MoO4·2H2O、190mg/L的NiCl2·6H2O、210mg/L的Na2SeO4·10H2O。所有實驗藥品均購自阿拉丁試劑有限公司。
1.3 分析項目與方法
NH4+-N采用納氏試劑分光光度法測定，NO2--N采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法測定，NO3--N采用紫外分光光度法測定，pH、DO和溫度采用WTW多參數(shù)測定儀測定�？偟园钡�、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮之和計算。另外，采集2個反應(yīng)器長期斷流前最后一天、恢復(fù)前最后一天以及恢復(fù)階段第52天的活性污泥樣品，送至上海生工生物工程有限公司，采用16SrRNA高通量測序技術(shù)檢測微生物群落結(jié)構(gòu)。
2、結(jié)果與討論
2.1 未經(jīng)Hg(Ⅱ)暴露反應(yīng)器斷流后的恢復(fù)性能
R1反應(yīng)器恢復(fù)過程的運行效果如圖2所示。在第Ⅰ階段（1～8d），水力停留時間（HRT）為6h，進(jìn)水氨氮平均濃度為195.1mg/L，控制曝氣量為0.1L/min，DO平均濃度為0.1mg/L。第1~3天，氨氮去除率平均值為47.4%，這說明經(jīng)過長期饑餓后AOB仍有一部分活性，可能是由于長期斷流期間缺乏營養(yǎng)基質(zhì)，導(dǎo)致部分微生物死亡分解為氨氮，為AOB提供了基質(zhì)。何麗金等將室溫儲存161d的厭氧氨氧化污泥進(jìn)行活性恢復(fù)，初始氨氮去除率為75.3%，與本研究結(jié)果一致。TN去除率和TN去除負(fù)荷分別為-24.7%、-0.201kg/（m3·d），可能是運行初期HRT較短，活性較差的微生物被淘汰，死亡的微生物溶解在反應(yīng)器中分解產(chǎn)生了氨氮，導(dǎo)致出水TN濃度高于進(jìn)水。接著運行5d，出水氨氮濃度逐漸增加，氨氮去除率下降至17.4%，可能是長期無基質(zhì)供給導(dǎo)致AOB表現(xiàn)出不穩(wěn)定性。亞硝態(tài)氮積累率為（91.3±5.2）%，這說明亞硝酸鹽氧化菌（NOB）在斷流期間因缺乏基質(zhì)已被淘汰，恢復(fù)初期系統(tǒng)內(nèi)起作用的菌屬主要是AOB。在第Ⅱ階段（9~17d），保持曝氣量不變，延長HRT至8h，使微生物與氮素充分接觸，與第Ⅰ階段末期相比，出水氨氮濃度最高下降了39.0mg/L，但氨氮去除率、亞硝態(tài)氮積累率與TN去除率平均值無明顯差異。
在第Ⅲ階段（18~38d），仍保持曝氣量不變，繼續(xù)延長HRT至12h，氨氮與TN去除率分別為（41.2±19.1）%、（25.7±18.9）%，亞硝態(tài)氮積累率下降至50.4%，出水檢測到少量硝態(tài)氮。推測可能是AnAOB有初步恢復(fù)的跡象，使得部分總氮被去除，但出水氨氮濃度仍較高。為有效恢復(fù)AOB與AnAOB的活性，在第Ⅳ階段（39~55d），將曝氣量提高至0.2L/min，其他運行條件保持不變，DO平均濃度仍為0.1mg/L，說明第Ⅲ階段的曝氣量不足以供給好氧微生物呼吸。此階段出水氨氮濃度立即下降，氨氮和TN去除率以及TN去除負(fù)荷逐漸增加，同時也伴隨著硝態(tài)氮的產(chǎn)生。第41天，出水氨氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮濃度分別為24.2、22.5、15.8mg/L，TN去除率和去除負(fù)荷分別為70.6%、0.300kg/（m3·d），ΔNO3--N/ΔNH4+-N為0.08，與理論值接近，認(rèn)為R1反應(yīng)器的CANON工藝成功恢復(fù)。繼續(xù)運行14d，TN去除率和去除負(fù)荷分別為（68.8±10.8）%、（0.273±0.043）kg/（m3·d），ΔNO3--N/ΔNH4+-N穩(wěn)定在0.10。R1反應(yīng)器采用提高HRT和曝氣量的方式，經(jīng)過55d的運行，成功恢復(fù)CANON工藝并實現(xiàn)高效穩(wěn)定運行。
2.2 Hg(Ⅱ)暴露反應(yīng)器斷流后的恢復(fù)性能
R2反應(yīng)器恢復(fù)過程的運行效果如圖3所示。第Ⅰ階段（1～3d）的運行條件與R1相同，采用6h的HRT和0.1L/min的曝氣量，反應(yīng)器內(nèi)DO平均濃度為0.6mg/L，而R1僅為0.1mg/L，說明R2的活性污泥消耗氧氣少，好氧微生物活性差。進(jìn)水氨氮平均濃度為186.3mg/L，出水氨氮和亞硝態(tài)氮平均濃度分別為134.7、45.8mg/L，氨氮去除率平均值為27.7%，這說明經(jīng)過長期饑餓后AOB仍保留了一部分活性，將部分氨氮氧化為亞硝態(tài)氮。相同條件下，R1的氨氮去除率為47.4%，說明R1中AOB的活性高于R2，這與反應(yīng)器內(nèi)DO濃度的差異一致。出水硝態(tài)氮平均濃度為2.2mg/L，TN去除率和去除負(fù)荷平均值分別為3.6%、0.027kg/（m3·d），說明AnAOB未表現(xiàn)出活性，活性污泥在斷流前Hg（Ⅱ）暴露及長期饑餓的雙重作用下，AnAOB活性受到嚴(yán)重的持久性抑制。亞硝態(tài)氮積累率平均值為96.1%，說明NOB已在系統(tǒng)中被抑制或者淘洗，在長期饑餓后系統(tǒng)內(nèi)起脫氮作用的菌群主要是AOB，與R1相同。Chen等的研究表明，厭氧氨氧化系統(tǒng)能夠完全抵抗低濃度Hg（Ⅱ）（≤10mg/L）的暴露，當(dāng)Hg（Ⅱ）濃度達(dá)到20mg/L時，表現(xiàn)出顯著的抑制作用，由此說明本研究中Hg（Ⅱ）的暴露對長期饑餓后厭氧氨氧化污泥活性的恢復(fù)具有不利影響。
在第Ⅱ階段（4~24d），將HRT提高至12h，基于AnAOB不能承受太高濃度的DO，將曝氣量調(diào)整為0.075L/min，DO隨之降為0.2mg/L。出水氨氮濃度緩慢降低，出水亞硝態(tài)氮濃度逐漸增加，第22~24天，氨氮去除率平均值為86.4%，說明AOB活性得到了恢復(fù)；TN去除率平均值為9.8%，說明AnAOB仍未表現(xiàn)出活性；亞硝態(tài)氮積累率平均值為92.6%，說明該系統(tǒng)的反應(yīng)只進(jìn)行到了短程硝化階段。研究表明，AnAOB的細(xì)胞密度>1010個/mL時才能顯現(xiàn)出活性，推測可能是AnAOB的細(xì)胞密度較低而未表現(xiàn)出活性。CANON工藝需要AOB與AnAOB的協(xié)同合作完成脫氮過程，此階段AOB活性已得到恢復(fù)。
在第Ⅲ階段（25~52d），保持HRT為12h，繼續(xù)減小曝氣量至0.05L/min，為AnAOB提供厭氧環(huán)境，DO平均濃度隨之降為0.1mg/L，出水氨氮濃度立即增加，氨氮去除率平均值為60.9%，說明降低DO濃度限制了AOB活性。TN去除率平均值為17.2%，說明AnAOB始終未表現(xiàn)出活性。經(jīng)過52d的運行，通過降低進(jìn)水氮負(fù)荷和DO濃度的方法進(jìn)行CANON工藝的恢復(fù)，TN去除率始終低于30%，TN去除負(fù)荷穩(wěn)定在0.105kg/（m3·d）以下，氨氮去除率和亞硝態(tài)氮積累率平均值分別為60.9%、92.3%，整個系統(tǒng)已由斷流前的CANON工藝轉(zhuǎn)變?yōu)槎坛滔趸に嚒４送�，在恢�?fù)階段第1天的出水中檢測到6.0μg/L的Hg（Ⅱ），說明Hg（Ⅱ）具有較強(qiáng)的累積毒性，這是因為重金屬不具有代謝的特性，其在微生物細(xì)胞內(nèi)難以排出或緩慢排出。Bi等通過批量實驗研究Hg（Ⅱ）對厭氧氨氧化的短期影響，發(fā)現(xiàn)Hg（Ⅱ）對厭氧氨氧化活性污泥具有持續(xù)的毒性，這進(jìn)一步說明Hg（Ⅱ）的累積毒性抑制了AnAOB活性的恢復(fù)。
2.3 運行性能與微生物特征的對比
為進(jìn)一步分析2個反應(yīng)器的恢復(fù)性能，采用高通量測序技術(shù)檢測在長期斷流前最后一天、恢復(fù)前最后一天與恢復(fù)階段第52天的微生物群落結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果如圖4所示。
由圖4可知，2個反應(yīng)器在不同階段的AnAOB均為Candidatus_Kuenenia，在斷流前的相對豐度分別為16.0%、10.3%，恢復(fù)前的相對豐度分別為9.4%、10.8%，長期饑餓后R2中AnAOB的相對豐度無明顯變化，可能是由于斷流前AnAOB在核糖體內(nèi)儲存能量，在斷流期間將其用作能量，R1與R2在恢復(fù)初期（1~3d）的TN去除負(fù)荷分別為-0.201、0.027kg/（m3·d），雖然AnAOB的相對豐度變化不大，但其經(jīng)過長期饑餓后活性較低�；謴�(fù)階段第52天，2個反應(yīng)器中AnAOB的相對豐度分別為4.8%、8.4%，TN去除負(fù)荷分別為0.294、0.102kg/（m3·d），AnAOB的相對豐度與TN去除負(fù)荷呈負(fù)相關(guān)，分析其原因：①R1中的優(yōu)勢菌是AnAOB，而R2中則為反硝化菌（27.8%）和AOB（11.9%）；②R1中檢測到的未分類微生物較多，相對豐度達(dá)到37.4%，而在R2中僅為9.5%；③R2中Hg（Ⅱ）的累積毒性抑制了AnAOB活性。
2個反應(yīng)器中的AOB均為Nitrosomonas，在斷流前的相對豐度分別為0.6%、0.5%，恢復(fù)前的相對豐度分別為21.0%、0.5%，恢復(fù)初期氨氮去除率分別為47.4%、27.7%，AOB的相對豐度與氨氮去除率一致；在恢復(fù)階段第52天，R1與R2中AOB的相對豐度分別為4.8%、11.9%，氨氮去除率分別為93.2%、58.9%。一方面，AOB的相對豐度與氨氮去除率呈負(fù)相關(guān)，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因與AnAOB一致，因此，R1中有一部分氨氮去除率是AnAOB完成的；另一方面，R1中AOB的相對豐度在恢復(fù)前增加，恢復(fù)后減小，也可能是AOB更容易恢復(fù)活性，AnAOB在后期恢復(fù)活性后，開始消耗氨氮，AOB因此減少。2個反應(yīng)器中微生物群落的對比結(jié)果表明，Hg（Ⅱ）的積累沒有直接將AOB與AnAOB滅活，而是抑制了其脫氮活性。
2個反應(yīng)器中的反硝化菌主要為Truepera、Xanthomonadaceae、Ignavibacterium。Xanthomonadaceae屬于變形菌門，有研究認(rèn)為其在SBR中具有反硝化作用。Truepera對環(huán)境具有高抵抗性。陳彥霖等認(rèn)為Ignavibacterium屬于厭氧異養(yǎng)菌，可能具有反硝化或異化硝酸鹽還原功能。在斷流前，R1中Xanthomonadaceae、Truepera、Ignavibacterium的相對豐度分別為17.2%、5.0%、6.1%，R2中為19.6%、4.4%、6.6%，2個反應(yīng)器中反硝化菌的相對豐度無明顯差異；恢復(fù)前，R1中Xanthomonadaceae、Truepera、Ignavibacterium的相對豐度分別為11.3%、2.8%、0，R2中為31.8%、6.0%、7.0%，R2中反硝化菌的相對豐度增加，可能是在長期斷流期間部分微生物由于缺乏基質(zhì)逐漸死亡，反硝化菌利用菌體死亡裂解產(chǎn)生的有機(jī)物而生存；恢復(fù)階段第52天，R1中Xanthomonadaceae、Truepera、Ignavibacterium的相對豐度分別為2.7%、1.4%、0，R2中為21.4%、4.6%、1.8%，說明R1的主要脫氮微生物是AOB與AnAOB，而R2則為AOB和反硝化菌，但R2并未表現(xiàn)出脫氮性能，可能是恢復(fù)階段反硝化菌可利用的有機(jī)碳源較少，而且反硝化菌總相對豐度的下降也證明其因缺乏基質(zhì)而死亡。因此，R2中的反硝化菌在恢復(fù)階段沒有起到脫氮作用。
2.4 Hg(Ⅱ)暴露影響工藝恢復(fù)的機(jī)理
2個反應(yīng)器經(jīng)過長期饑餓后，恢復(fù)初期的脫氮性能均較差。R1能夠成功恢復(fù)CANON工藝并穩(wěn)定運行的主要原因是：①適當(dāng)延長HRT。彭永臻等研究發(fā)現(xiàn)，在較低的氮負(fù)荷下，微生物可以分泌更多的胞外聚合物，而且降低氮負(fù)荷減小了對微生物的沖擊，更有利于系統(tǒng)脫氮功能菌的恢復(fù)。Chen等研究發(fā)現(xiàn)，HRT從24~48h下降到12h，TN去除率從90%下降到80%。在本研究中，R1的HRT從第Ⅰ階段的6h逐漸增加至第Ⅲ階段的12h，TN去除率從-24.7%增加至（25.7±18.9）%，AnAOB有初步恢復(fù)的跡象。這充分說明適當(dāng)延長HRT有利于微生物與基質(zhì)充分接觸，進(jìn)一步促進(jìn)微生物的生長。②適當(dāng)調(diào)整曝氣量，將反應(yīng)器內(nèi)DO濃度控制在0.1mg/L，為AOB與AnAOB提供適宜的生存環(huán)境，同時有效抑制了NOB的活性。李亞峰等采用UASB反應(yīng)器研究HRT、DO和有機(jī)物對厭氧氨氧化脫氮性能的影響，發(fā)現(xiàn)HRT和DO的影響較大，有機(jī)物的影響較小，同時DO較高時，雖然反應(yīng)受到影響，但隨之降低DO，脫氮性能可逐漸恢復(fù)。在本研究中，R1的曝氣量從第Ⅲ階段的0.1L/min增加至第Ⅳ階段的0.2L/min，TN去除率由（25.7±18.9）%增加至（68.8±10.8）%，這說明有效調(diào)控DO濃度是CANON工藝恢復(fù)的關(guān)鍵。因此，經(jīng)過長期斷流的自養(yǎng)脫氮污泥，可以采用提高HRT、降低氮負(fù)荷以及調(diào)控DO的方式進(jìn)行微生物活性的恢復(fù)。
R1與R2在恢復(fù)前的運行條件完全相同，恢復(fù)期間的反應(yīng)器形式、進(jìn)水基質(zhì)及濃度也相同，而R2采用同樣的方式卻沒有成功恢復(fù)CANON工藝，主要原因是：R2在長期斷流前曾經(jīng)在Hg（Ⅱ）下長期暴露，再經(jīng)過長達(dá)5個月的室溫靜置后導(dǎo)致AnAOB的活性難以恢復(fù)。有研究通過批量實驗發(fā)現(xiàn)，Hg（Ⅱ）的半抑制濃度（IC50）為2.3mg/L，厭氧氨氧化活性污泥具有較高的重金屬累積能力，這也是活性被抑制的關(guān)鍵原因，同時活性污泥和胞外聚合物所具有的官能團(tuán)可能有助于重金屬的吸附。此外，在Hg（Ⅱ）暴露下，肼脫氫酶活性和血紅素C濃度也降低，這說明Hg（Ⅱ）容易吸附在微生物細(xì)胞內(nèi)。有研究評估了銅、鎘和汞在不同劑量單獨或聯(lián)合添加對微生物群落結(jié)構(gòu)的短期影響，結(jié)果表明，金屬毒性存在累積效應(yīng)。Pei等研究表明，Hg的累積能力很強(qiáng)，可以使微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。在開始恢復(fù)的第1天R2出水中也檢測到了微量的Hg（Ⅱ），Hg（Ⅱ）在微生物細(xì)胞內(nèi)長期存在，抑制了AnAOB活性，導(dǎo)致其難以恢復(fù)。在恢復(fù)階段的第52天，R2中的優(yōu)勢菌屬是AOB和反硝化菌，也進(jìn)一步證明了Hg（Ⅱ）對AnAOB的持久抑制性。此外，R2的氨氮去除率和亞硝態(tài)氮積累率平均值分別為60.9%、92.3%，整個系統(tǒng)已由斷流前的CANON工藝轉(zhuǎn)變?yōu)槎坛滔趸に�。在實際應(yīng)用中，一方面，由于NOB難以被抑制，導(dǎo)致短程硝化工藝很難實現(xiàn)，R2的污泥可以直接作為短程硝化的種泥來源，解決短程硝化工藝啟動難的問題；另一方面，R2的污泥可以與厭氧氨氧化反應(yīng)器串聯(lián)，成為兩級式的短程硝化-厭氧氨氧化工藝，但不能單獨作為厭氧氨氧化污泥發(fā)揮脫氮作用。
3、結(jié)論
①未經(jīng)Hg（Ⅱ）暴露的R1在長期斷流后，經(jīng)過55d的運行，TN去除率恢復(fù)至（68.8±10.8）%；而經(jīng)過Hg（Ⅱ）長期暴露的R2，TN去除率始終低于30%，亞硝態(tài)氮積累率達(dá)到（93.5±6.5）%，CANON工藝轉(zhuǎn)變?yōu)槎坛滔趸に嚒?/span>Hg（Ⅱ）在微生物細(xì)胞內(nèi)難以排出而長期積累，使AnAOB受到了Hg（Ⅱ）的持久性抑制，從而導(dǎo)致CANON工藝未成功恢復(fù)。
②高通量測序結(jié)果表明，R1中AnAOB和AOB的相對豐度在斷流前分別為16.0%、0.6%，恢復(fù)前為9.4%、21.0%，恢復(fù)后為4.8%、4.8%；而在R2中，長期斷流前分別為10.3%、0.5%，恢復(fù)前為10.8%、0.5%，恢復(fù)后為8.4%、11.9%。
③經(jīng)過長期斷流的自養(yǎng)脫氮污泥，可以采用提高HRT、降低氮負(fù)荷以及調(diào)控DO的方式進(jìn)行微生物活性的恢復(fù)；經(jīng)過Hg（Ⅱ）長期暴露后，再經(jīng)過長期斷流的自養(yǎng)脫氮污泥可以作為短程硝化的種泥來源，與厭氧氨氧化反應(yīng)器串聯(lián)發(fā)揮脫氮作用。（來源：鄭州輕工業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院環(huán)境污染治理與生態(tài)修復(fù)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心）
